HPLC 法测定蕲蛇药酒中马钱苷酸和龙胆苦苷的含量

眭荣春，李金林，周玉春，肖云，王志春

1.江西大自然制药有限公司，江西 吉安 343000；2.江西纳弗堂制药有限公司，江西 宜春 336000

蕲蛇药酒起源于明朝年间，胡卓人蕲蛇药酒的制作技艺为江西省吉安市吉州区传统医药和江西省省级非物质文化遗产之一。蕲蛇药酒执行质量标准为部颁标准中药成方制剂第五册（标准号：WS3-B-1063-91）［1］，只有性状、鉴别和常规制剂通则检查项，无含量测定项目，在质量控制中存在一定的缺陷。目前关于蕲蛇药酒含量测定也未见文献报道。为了更好地控制其质量，本研究建立HPLC 法测定蕲蛇药酒中两种成分（马钱苷酸和龙胆苦苷）的含量，以填补蕲蛇药酒含量测定项的空白，更好地控制蕲蛇药酒的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KQ2200DB 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FA2004B 型电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；ESJ203-S 型电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；HH-4 数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）。

1.2 试药

龙胆苦苷对照品（批号为110770-202219，纯度为98.1%），马钱苷酸对照品（批号为111865-202005，纯度为97.5%），均购自中国食品药品检定研究院。蕲蛇药酒（江西大自然制药有限公司，国药准字Z36020910，规格：每瓶装500 mL；批号：20200501、20200502、20200901、20200902、20210201、20210501、20210701、20211101、20211102、20211201）。甲醇和乙腈为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；水为纯净水(杭州娃哈哈公司)；其余试剂为分析纯。

2 方法和结果［2-6］

2.1 色谱条件

采用Ultimate Plus C18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）为流动相，按表1 进行梯度洗脱；流速为1.0 mL/min；检测波长为254 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

表1 流动相梯度洗脱表

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称定马钱苷酸对照品16.15 mg、龙胆苦苷对照品25.70 mg，加甲醇制成每1 mL 含马钱苷酸0.157 5 mg、龙胆苦苷0.252 1 mg 的混合溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取蕲蛇药酒适量，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按蕲蛇药酒处方组成除秦艽药材外其余药材，用白酒作溶剂，蔗糖为辅料，按蕲蛇药酒的制备工艺和“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 专属性考察

分别精密吸取“2.2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果如图1 所示，待测成分的色谱峰分离度良好，阴性对照溶液对待测成分无干扰，表明该方法专属性好。

图1 高效液相色谱图：A.对照品溶液；B.阴性对照溶液；C.供试品溶液

2.4 线性关系考察

精密称定马钱苷酸对照品16.15 mg、龙胆苦苷对照品25.70 mg，加甲醇制成含马钱苷酸浓度依次为0.012 60 mg/mL、0.031 5 mg/mL、0.063 0 mg/mL、0.157 5 mg/mL、0.314 9 mg/mL，含龙胆苦苷的浓度依次为0.020 17 mg/mL、0.050 4 mg/mL、0.100 8 mg/mL、0.252 1 mg/mL、0.504 2 mg/mL 的混合溶液。按“2.1”项下色谱条件测定，以峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，建立回归方程，得马钱苷酸回归方程为Y=7.0×106X-5 543.6，r=0.999 9，龙胆苦苷回归方程Y=1.0×107X-19 909，r=0.999 9，表明马钱苷酸和龙胆苦苷分别在0.012 60 mg/mL～0.314 9 mg/mL 和0.020 17 mg/mL～0.504 2 mg/mL 浓度范围内与峰面积的线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密量取含马钱苷酸0.157 5 mg/mL、龙胆苦苷0.252 1 mg/mL 的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录马钱苷酸和龙胆苦苷峰面积，结果马钱苷酸峰面积RSD（n=6）为0.27%，龙胆苦苷峰面积RSD（n=6）为0.26%，表明该仪器具有良好的精密度。

2.6 稳定性试验

取蕲蛇药酒（批号20211201），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样分析，分别测定马钱苷酸和龙胆苦苷在0、2、4、8、12、24 h 峰面积，结果马钱苷酸和龙胆苦苷峰面积RSD（n=6）分别为0.96%和0.40%，表明蕲蛇药酒供试品溶液在24 h 内稳定。

2.7 重复性试验

取蕲蛇药酒（批号20211201），按“2.2.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果测得马钱苷酸和龙胆苦苷峰面积RSD（n=6）分别为1.05%和1.26%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率实验

精密量取已知含量的蕲蛇药酒（批号20211201）六份，每份2.5 mL，分别置5 mL 量瓶中，各精密加入含马钱苷酸0.246 1 mg/mL 和龙胆苦苷0.759 3 mg/mL 的混合对照品甲醇溶液1 mL，并加甲醇至刻度，摇匀。按“2.2.2”项下方法制备加样回收供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录马钱苷酸和龙胆苦苷峰面积，计算蕲蛇药酒中2种成分含量，结果见表2、表3，表明该方法的准确度高。

表2 马钱苷酸回收率测定结果

表3 龙胆苦苷回收率测定结果

2.9 样品测定

取10 批蕲蛇药酒样品，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱峰面积，计算2 种成分的含量，结果见表4。

表4 10批蕲蛇药酒含量测定结果 mg/mL

3 讨论

3.1 检测成分的选择

蕲蛇药酒由蕲蛇（去头）、秦艽、防风、当归、红花、羌活和香加皮等7 味中药组成，具有活血通络，祛风除湿的功效。其中秦艽为蕲蛇药酒主要功效成分，秦艽化学成分复杂，一般认为环烯醚萜苷类是其主要有效成分之一，龙胆苦苷为秦艽中含量最高的化学成分，也是秦艽中主要活性成分及苦味成分，龙胆苦苷具有保肝利胆［7］、抗炎［8-9］、升血糖及对中枢神经系统的作用［10］；马钱苷酸具有一定的抗炎活性，也为秦艽主要活性成分［11］。因此，为了更有效地控制成药质量，本研究采用了HPLC法测定蕲蛇药酒中马钱苷酸和龙胆苦苷的含量。

3.2 流动相考察

本实验参考了《中国药典》2020 年版一部和相关文献［2-6］，确定流动相以乙腈为有机相，并考察了不同浓度的磷酸和醋酸对蕲蛇药酒供试品溶液中待测组分分离的影响，结果不同浓度的酸对分离效果影响不大，磷酸较醋酸对待测组分分离效果好，故选择0.1%磷酸溶液为水相。

3.3 检测波长的选择

参考《中国药典》2020 年版一部中秦艽含量测定项和相关文献［2-6］，供试品溶液按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果马钱苷酸和龙胆苦苷在254 nm波长处都有较大吸收，故选择254 nm 波长作为检测波长。

3.4 小结

本研究建立以高效液相色谱法测定蕲蛇药酒中马钱苷酸和龙胆苦苷含量的方法，方法简便，结果准确，可对蕲蛇药酒的质量进行有效控制。通过对10 批蕲蛇药酒中马钱苷酸和龙胆苦苷进行含量测定，马钱苷酸和龙胆苦苷总量在0.213 mg/mL～0.411 mg/mL 之间，通过查询制剂所用秦艽饮片的检验报告，可知马钱苷酸和龙胆苦苷两种成分含量差异较大，推断是所用饮片含量不同而导致不同批次成品中这两种成分含量差异较大。根据《中国药典》2020 年版中秦艽饮片的含量限度以及在处方中的实际用量，按转移率90%计算，推算蕲蛇药酒中含秦艽以马钱苷酸和龙胆苦苷总量计应不得少于0.135 mg/mL，10 个批次成品含量均大于拟定限度。本次研究仍存在不足之处，如缺少其他药味有效成分的含量测定和指纹图谱研究等，后续将进一步进行多成分定量分析和指纹图谱研究，从而更全面地评价蕲蛇药酒的内在质量。