穿心莲内酯对细菌内毒素所致脓毒症的体内外拮抗研究

童凌斐，胡建新

江西省人民医院（南昌医学院第一附属医院），江西 南昌 330006

由细菌引起的临床危重感染特别是脓毒症日益增多，尽管使用了包括碳青霉烯类在内的各种强效广谱抗菌药物，但感染患者的死亡率仍居高不下［1］。其原因可能与抗菌药物在杀死细菌的同时会诱导释放大量的内毒素引起全身炎症反应和严重脓毒症相关，从而导致临床最终治疗失败［2］。内毒素是革兰阴性菌细胞壁的重要组成成分［3］。巨噬细胞在内毒素的作用下释放相关的炎症因子，进而引发全身炎症反应综合征（SIRS）反应，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、血清炎症因子白介素-6（IL-6）等炎症因子浓度会升高［4］。作为中药爵科植物穿心莲有效成分之一的穿心莲内酯，既往研究能有效减轻机体的炎症反应［5］，从而提高临床疗效，但穿心莲内酯所发挥作用的物质基础并不十分明确，是否能直接中和或破坏内毒素结构的具体成分尚未明确，因此以其为例进行研究，进行体内外拮抗试验，明确其相关作用，对未来防治脓毒症具有重要的参考意义。

1 材料

1.1 试剂和药物

鲎试剂盒（厦门市鲎试剂实验厂有限公司，0.1～1.0 EU/mL）；脂多糖（LPS，美国sigma-aldrich公司，大肠杆菌0111:B4，批号L5293-2ML）；穿心莲内酯（阿拉丁试剂上海有限公司）；RAW264.7 细胞（中国科学院上海生化与细胞研究所），内毒素检测用水（厦门市鲎试剂实验厂有限公司）；IL-6 ELISA 试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，EK0412）；TNF-α ELISA 试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，EK0526）。DMEM 细胞培养基（赛默飞世尔生物化学制品有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物科技有限公司），其余试剂均为分析纯，所有实验用水均为去离子超纯水。

1.2 试验动物与仪器

清洁级KM 小鼠50 只（体重18～20 g/只，南昌大学实验动物中心，实验动物许可编号：ncdx2019102，雌雄兼用，雌鼠未孕）；鲎试验微生物快速检测系统ELx808IU-SN（厦门市鲎试剂实验厂有限公司）。

2 方法

2.1 体外中和内毒素实验

首先将实验分组为：LPS 组，LPS+穿心莲内酯组，穿心莲内酯对照组（40 μg/mL）。LPS 组作为阳性对照；LPS 组、LPS+穿心莲内酯组中的LPS 剂量均为10 ng/mL；配置好为80、40 和20 μg/mL 的穿心莲内酯浓度，再加入LPS 10 ng/mL 分别在37 ℃培养箱内孵育30 min 进行体外中和实验，与LPS 组进行对比以探究穿心莲内酯的作用。取孵育后样品100 μL，每个样品设6 复孔，每组样品中的LPS 可通过鲎试剂动态浊度法检测。被穿心莲内酯中和的内毒素占加入的内毒素总量的百分比表示清除率：清除率=（内毒素总量-未被中和的内毒素量）/内毒素总量×100%。

2.2 穿心莲内酯对LPS 刺激RAW264.7 表达细胞因子的抑制实验

首先在DMEM 培养液中加入10%的胎牛血清、100 U/mL 的链霉素和100 U/mL 的青霉素，于37 ℃含5% CO2的培养箱中培养。调整RAW264.7 细胞数为1×105/mL 在48 孔细胞培养板培养；其中0.5 mL细胞液/孔对小鼠巨噬细胞株RAW264.7 进行培养。

用10 ng/mL 的LPS 刺激RAW264.7 细胞1 h 后，之后分别加入80、40、20 μg/mL 的穿心莲内酯，共同孵育4 h 取上清测相关的炎性因子，根据对应添加的穿心莲内酯浓度的不同，观察其对内毒素刺激RAW264.7 细胞表达细胞因子的抑制作用的量效关系，ELISA 法检测培养液上清中TNF-α 和IL-6 的浓度。以LPS组作为LPS+穿心莲内酯组的阳性对照。

2.3 穿心莲内酯对LPS 攻击小鼠的保护实验

体重18～20 g/只的KM 小鼠雌雄各25 只，编号后随机分组。分别设空白对照组，LPS 对照组，LPS+穿心莲内酯组（高、中、低三个浓度）；每组10 只小鼠，穿心莲内酯的药物浓度分别为160，80和40 mg/kg，LPS：18 mg/kg。均 按300 μL/20 g 体积对所有小鼠进行注射，之后6 h 后去除眼球采血。同时检测小鼠血清中的IL-6 和TNF-α 浓度，分析LPS 攻击小鼠的炎症反应以及穿心莲内酯在体内对LPS 的抑制和拮抗作用。

2.4 统计学方法

采用GraphPad Prism 5 统计学软件进行分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 体外中和内毒素实验

与LPS 对照组比较，高、中、低剂量的穿心莲内酯在体外均有不同程度的中和内毒素作用，测定值与对照组比较均显著降低（见表1）。随着穿心莲内酯浓度的成倍升高，内毒素清除也增加，显示穿心莲内酯具有体外清除内毒素的作用。

表1 3种不同浓度穿心莲内酯的体外中和内毒素试验

3.2 穿心莲内酯对LPS 刺激RAW264.7 的抑制实验

抑制试验中细胞上清液IL-6 和TNF-α 的Elisa 检测结果如图1 和2 所示。在空白对照组中，RAW264.7 细胞的培养上清液中IL-6、TNF-α 含量极低。当给予10 μg/mL LPS 刺激后，RAW264.7细胞分泌的IL-6、TNF-α 含量显著增高，分别达到75.3 pg/mL 和360.2 pg/mL，随后分别与80、40、20 μg/mL 的穿心莲内酯孵育时，三组治疗组均能不同程度地降低RAW264.7 细胞分泌的IL-6 和TNF-α 含量。其中80 μg/mL 的穿心莲内酯能显著降低抑制试验中的IL-6 和TNF-α 水平，分别对应降至23.2 pg/mL 和88.9 pg/mL 左右，结果表明穿心莲内酯能抑制LPS 对RAW264.7 细胞产生的炎症刺激作用，当其浓度越高时效果更显著，各浓度组与LPS 组比较，均差异有统计学意义（均P＜0.001），并且各浓度组间也差异有统计学意义。

图1 三种浓度的穿心莲内酯抑制试验中IL-6结果

图2 三种浓度的穿心莲内酯对抑制试验中TNF-α结果

3.3 穿心莲内酯对LPS 攻击小鼠的保护实验

给予小鼠尾静脉注射18 mg/kg 的LPS，统计空白对照组、LPS 对照组、LPS+40 μg/mL、LPS+80 μg/mL 和LPS+160 μg/mL 各组小鼠注射6 h 后IL-6和TNF-α 含量来确定小鼠保护试验的结果，统计数据如表2 所示。注射LPS 入体内6 h 后，LPS 对照组的血清TNF-α 和IL-6 浓度分别高达789.1 和897.5 pg/mL。给予穿心莲内酯160 μg/mL 时，小鼠血清TNF-α 和IL-6 的数值明显下降至LPS 对照组的TNF-α 和IL-6 浓度的四分之一以下，分别为168.3 和200.4 pg/mL。选取尾静脉注射18 mg/kg 的LPS 来攻击小鼠时，反馈穿心莲内酯对其有保护作用，而且与浓度呈正相关，各浓度组间与LPS 比较，均差异有统计学意义（均P＜0.001），并且各浓度组间也差异有统计学意义。

表2 LPS三种浓度的穿心莲内酯对LPS攻击小鼠6 h后的IL-6和TNF-α值（） pg/mL

表2 LPS三种浓度的穿心莲内酯对LPS攻击小鼠6 h后的IL-6和TNF-α值（） pg/mL

4 讨论

家兔法虽然是热原反应检查的首选，但只能定性且操作繁琐，难以用于内毒素定量，故本实验采用鲎试验法，相对操作简单［6］。脓毒症所产生的炎性因子是感染性疾病发生过程中重要的组成部分，某种程度上可决定脓毒症的转归，炎症因子中TNF-α 和IL-6 相对较活跃［7］。有研究表明，在治疗铜绿假单胞菌引起的脓毒症患者时，穿心莲内酯可减少侵袭的细菌数量，降低细菌感染所致上皮细胞乳酸脱氢酶的释放及线粒体损伤，降低机体损伤程度［8］。本研究表明，穿心莲内酯在体外可以一定程度中和内毒素；在对LPS 刺激RAW264.7 细胞的抑制实验中，穿心莲内酯浓度越高，IL-6 和TNF-α 相对清除越多；穿心莲内酯对LPS 攻击小鼠的保护实验结果显示，不同浓度的穿心莲内酯均具有一定的抗炎作用，表明体内LPS 可被其有效清除，避免更大的炎症连锁级联反应。

综上所述，穿心莲内酯可抑制或中和细菌的LPS 产生，可减少炎症反应产生的IL-6 和TNF-α，从而减少炎症风暴的产生，减少脓毒症对相关脏器的损伤，为中医辅助治疗脓毒症或脓毒症休克提供理论依据，为后续的中西医合璧治疗提供新思路。