瑶药祛风活络喷雾剂质量标准及微生物限度检查方法研究

邱琼华，李隽永，韦倩，张新林，毛桂福

柳州市中医医院，广西 柳州 545001

祛风活络喷雾剂是由四方藤、黄锁梅根、续断、铁包金、五指毛桃、大钻、鸡血藤、石南藤等壮瑶药组方而成,经55%乙醇渗漉制成的外用制剂，具有通经活络，消肿止痛等功效。该处方在柳州市中医医院使用多年，临床主要用于风湿痹痛，腰肌劳损。该制剂中原料药物四方藤［1］在瑶医学中具有祛风除湿，舒筋通络的作用，可用于崩闭闷（风湿、类风湿性关节炎），锥碰江闷（坐骨神经痛），改闷（腰痛、腰肌劳损），播冲（跌打损伤）等，是祛风活络喷雾剂中主要起效的药味，其指标成分岩白菜素具有镇痛抗炎的作用［2］；续断则能强筋骨，续折伤，是骨伤科常用中药，其活性成分川续断皂苷Ⅵ在现代药理学研究中显示了对骨组织的保护作用，同时也有一定镇痛作用［3-4］。所以本研究在考虑该制剂质量标准制定时，重点研究了上述两味药物的定性与定量的检验方法。此外，开展制剂的微生物检验方法研究，是保证制剂安全性的前提［5］，故本研究同时对制剂的微生物检验方法适用性进行试验，为祛风活络喷雾剂的质量检验提供依据，也为其他民族制剂的质量标准的制定提供参考。

1 设备与试剂

1.1 设备

1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；AL204 分析天平（德国梅特勒托利多公司）；KQ-800DE 超声器（昆山市超声仪器有限公司）；SQP 电子分析天平（德国赛多利斯公司）。ZF-1 型三用紫外分析仪（杭州齐威仪器有限公司）；DNP-9162BS-Ⅲ型电热恒温培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）；MJX-100B-Z 型霉菌培养箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；YRH-150 型生化培养箱（上海姚氏仪器设备厂）；XG1.C 型卧式压力灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司）；VS-1300L-U 型净化工作台、BSL-1004 ⅡA2 型生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）。

1.2 试药

祛风活络喷雾剂3 批（20220101、20220201、20220202，均由柳州市中医医院制剂室生产）；岩白菜素对照品（批号：MUST-21060907，纯度99.65%），川续断皂苷Ⅵ对照品（批号：MUST-21012211，纯度98.95%）均购于成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：1105831），胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA，批号：1105271），胰酪大豆胨液体培养基（TSB，批号：1101551），沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA，批号：1105071）等，均购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 菌株

金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的CMCC 号分别是［CMCC（B）26003、CMCC（B）63501、CMCC（B）10 104、CMCC（F）98001、CMCC（F）98003、CMCC（B）44102、CMCC（B）50094］，试验所用菌株均为第3 代，均购自广东环凯微生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 四方藤、续断的定性鉴别

2.1.1 四方藤 取样品20 mL，加石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（2∶1）混合溶液30 mL，振摇，取下层溶液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取岩白菜素对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。同时制备相应的缺四方藤阴性样品溶液。照薄层色谱法试验［6］，吸取上述三种溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇（2∶2.5∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%铁氰化钾-2%三氯化铁（1∶1）的混合溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果如图1，显示该方法可行且无阴性干扰。

图1 祛风活络喷雾剂中四方藤的薄层色谱图

2.1.2 续断 取样品20 mL，用乙醚振摇提取2 次，每次20 mL，弃去乙醚液，再用水饱和的正丁醇提取2 次，每次20 mL，合并正丁醇液，再用氨试液、正丁醇饱和的水各洗涤2 次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取川续断皂苷Ⅵ对照品，加甲醇制成每1 mL 含2 mg 的溶液，作为对照品溶液。同时制备相应的缺续断的阴性样品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各3 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%磷钼酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰。结果见图2，显示该方法可行且无阴性干扰。

图2 祛风活络喷雾剂中续断的薄层色谱图

2.2 岩白菜素、川续断皂苷Ⅵ的含量测定［7-8］

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脱（见表1）；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为212 nm；进样量10 μL。

表1 祛风活络喷雾剂含量测定梯度洗脱表

2.2.2 混合对照品溶液的制备 取岩白菜素、川续断皂苷Ⅵ对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL 分别含岩白菜素51.07 μg、川续断皂苷Ⅵ207.60 μg 的混合溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取样品（批号：20220101）5 mL，置25 mL 量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液即得。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 分别制备缺四方藤与缺续断的阴性样品，并按“2.2.3”项下方法制备阴性样品溶液。

2.2.5 系统适应性和专属性试验 按“2.2.1”项下色谱条件对上述三种溶液进样测定，结果见图3。

图3 HPLC图：A.混合对照品；B.祛风活络喷雾剂样品；C.缺四方藤阴性样品；D.缺续断阴性样品

结果显示岩白菜素、川续断皂苷Ⅵ与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，且无阴性干扰，表明该方法具有较好的专属性。

2.2.6 线性关系考察 取岩白菜素对照品配制成质量浓度分别为12.77、25.54、51.07、76.61、102.14、127.68 μg/mL；川续断皂苷Ⅵ对照品配制成质量浓度分别为51.90、103.80、207.60、311.40、415.19、518.99 μg/mL 的系列混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定。以对照品浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，岩白菜素和川续断皂苷Ⅵ分别在12.77～127.68 μg/mL 和51.90～518.99 μg/mL 质量浓度范围内线性关系良好。回归方程分别为岩白菜素Y=4.11×10X+45.725，r=0.999 7；川续断皂苷ⅥY=1.75X+0.178，r=0.999 9。

2.2.7 精密度试验 取同一供试品溶液连续进样6次，以岩白菜素和川续断皂苷Ⅵ的峰面积计算，RSD 分别为2.88%、1.58%，说明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，在0、2、4、6、8、12 h 分别进样，以岩白菜素、川续断皂苷Ⅵ的峰面积计算，RSD 分别为2.81%、0.41%，表明供试品溶液在12 h 内稳定。

2.2.9 重复性试验 取祛风活络喷雾剂（批号：20220101），按“2.2.3”项下方法制备6 份供试品溶液，进样测定，结果显示岩白菜素、川续断皂苷Ⅵ含量的RSD 分别为1.29%、0.32%，说明该方法具有良好重复性。

2.2.10 加样回收率试验 精密量取祛风活络喷雾剂（批号：20220101）6 份各2.5 mL，每份分别加入岩白菜素对照品510.71 μg、川续断皂苷Ⅵ对照品556.98 μg，用50%甲醇定容至25 mL，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率及RSD。详见表2、表3。结果显示岩白菜素、川续断皂苷Ⅵ 的平均加样回收率分别为100.30%、101.04%，RSD分别为0.77%、0.51%，说明该方法准确度较高。

表2 岩白菜素加样回收率试验

表3 川续断皂苷Ⅵ加样回收率试验

2.2.11 样品的含量测定 取祛风活络喷雾剂样品3批，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，结果见表4，岩白菜素和川续断皂苷的平均含量分别为244.9 μg/mL、789.0 μg/mL，RSD 分别为1.41%、3.56%。

表4 三批祛风活络喷雾剂的含量测定结果

3 微生物计数方法学试验

3.1 微生物检查常规法

3.1.1 菌悬液的制备 按《中国药典》2020 年版方法，把金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉制成菌落数不大于104cfu/mL的菌悬液。

3.1.2 供试品溶液的制备 以pH 7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制备1∶10 供试品溶液。试验组：供试品溶液（9.9 mL）5 份，分别加入“3.1.1”项下5 种菌悬液0.1 mL，混匀，各取1 mL 注皿，平行制备2份。供试品对照组：取供试品溶液（9.9 mL），分别加入试验组对应的稀释液0.1 mL，混匀，各取1 mL注皿，平行制备2 份。菌液对照组：分别取“3.1.1”项下5种菌悬液0.1 mL，并用试验组对应的稀释液9.9 mL 混匀，各取1 mL 注皿，平行制备2 份。

试验菌加样回收测定：上述各组，按药典方法进行培养。回收比值=（试验组菌落数-供试品对照组菌落数）/菌液对照组菌落数，其范围应为0.5～2.0。结果见表5，由结果可知，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌回收比均小于0.5，不满足加样回收的要求，表明本样品1∶10 供试品溶液对需氧菌、酵母菌有一定的抑制作用，需进一步实验。

表5 常规法试验菌株回收比（n=3）

3.2 薄膜过滤法

3.2.1 菌悬液的制备 方法同“3.1.1”项，但制备为各菌落数不大于100 cfu/mL 的菌悬液。

3.2.2 供试品溶液的制备 先以pH 7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成1∶10 供试品溶液；再取1∶10供试品溶液1 mL，用100 mL pH 7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液稀释，摇匀，备用。试验组：取混匀的备用供试品溶液进行薄膜过滤，用200 mL pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液分2 次进行冲洗，并在末次冲洗中分别加入“3.2.1”项下各菌悬液1 mL。每种菌株平行制备2 张滤膜，菌面朝上，置于相应的琼脂平皿中。供试品对照组：取混匀的备用供试品溶液进行薄膜过滤，冲洗方法同上述试验组，但无须加入菌悬液。菌液对照组：用200 mL pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液分2 次进行冲洗，并在末次冲洗液中分别加入各菌悬液1 mL，各平行制备2份进行培养。

试验菌加样回收测定：分别按需氧菌总数以及霉菌和酵母菌总数计数的试验条件进行培养，并计算加样回收比值。结果见表6，由结果可知，使用薄膜过滤法消除了制剂的抑菌作用，各菌株的回收比均大于0.5，满足加样回收的要求，表明该方法适用于祛风活络喷雾剂的微生物计数。

表6 薄膜过滤法试验菌株回收比（n=3）

3.3 控制菌检查法的适用性试验

3.3.1 金黄色葡萄球菌 （1）试验组：取“3.2.2”项下1∶10 供试品溶液3 份各10 mL，分别置于100、200、300 mL 胰酪大豆胨液体培养基（TSB）中，并分别加入“3.2.1”项下含有菌落数不大于100 cfu/mL的金黄色葡萄球菌悬液1 mL，混匀。（2）菌液对照组：以10 mL 稀释液替代供试品溶液加入不同体积TSB 中，其余操作方法与试验组相同。（3）供试品组：取“3.2.2”项下1∶10 供试品溶液10 mL，并以稀释液代替菌悬液，其余操作方法与试验组相同。（4）稀释液组：以10 mL 稀释液代替供试品溶液，不加菌液，其余操作方法与试验组相同。

3.3.2 铜绿假单胞菌 实验方法同“3.2.1”，所加菌悬液为菌落数不大于100 cfu/mL 的铜绿假单胞菌按2020 版《中国药典》（通则1106）规定方法培养并划线，观察结果。

结果显示，以100、200、300 mL TSB 为培养基体积时，试验组、菌液对照组均检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌，稀释液组与供试品组则都无菌生长，提示祛风活络喷雾剂对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌均无抑菌作用，可用常规法进行该控制菌检查，且TSB 的培养体积为100 mL。

3.4 微生物限度检查

根据上述试验的结果，需氧菌、霉菌和酵母菌按薄膜过滤法，控制菌按100 mL TSB 培养体积对祛风活络喷雾剂的微生物限度进行检查，结果见表7。三批样品均符合2020 年版《中国药典》四部对不含药材原粉的中药液体口服制剂及局部给药制剂的限度要求。

表7 三批样品微生物限度检查结果

4 讨论

4.1 薄层鉴别研究

由于四方藤与续断均是祛风活络喷雾剂组方中的主要药味，故开展定性鉴别研究。前期预实验显示，四方藤的供试品溶液制备时，单独使用甲醇、乙酸乙酯、石油醚（60～90 ℃）去除杂质，样品的斑点均出现严重拖尾现象，而使用乙酸乙酯-石油醚（60～90 ℃）（1∶2）去除杂质，样品斑点清晰，无其他干扰。此外，考察了不同温度（4 ℃、25 ℃），不同湿度（33%、60%、88%）对样品中四方藤、续断药材薄层鉴别的影响，发现温湿度不影响实验结果。

4.2 含量测定方法研究

本研究摸索了祛风活络喷雾剂中指标成分岩白菜素和川续断皂苷Ⅵ的HPLC 含量测定方法，预实验对岩白菜素和川续断皂苷Ⅵ分别在190～400 nm 范围内进行了紫外扫描，结果岩白菜素在220 nm 和275 nm 处有最大吸收，川续断皂苷Ⅵ在近紫外端212 nm 下具有较强吸收，且这两个成分在212 nm处均有较强吸收，故选取212 nm 作为本实验的吸收波长。其次，因含量测定中两个待测指标成分极性差异较大［9-10］，故采用梯度洗脱模式达到分离要求。对流动相进行考察时，发现乙腈-0.2%磷酸溶液体系分离效果好，故选择其为流动相。本实验还对样品稀释溶剂（50%甲醇、70%甲醇、甲醇）进行了考察，发现当使用70%甲醇或甲醇稀释时，岩白菜素的色谱峰出现分叉，可能由于样品溶剂与流动相极性相差较大导致；而用50%甲醇稀释时，岩白菜素色谱峰未出现分叉情况。

4.3 微生物检验方法学研究

本研究中祛风活络喷雾剂为使用乙醇渗漉制备的外用制剂，按非无菌不含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准检查。选择微生物计数方法时，由于常规法具有操作简单、结果准确、成本较低的优点，故首先采用常规法试验。结果发现，常规法对需氧菌、酵母菌均有一定的抑制作用，故使用薄膜过滤法消除其抑菌效力，结果显示各菌株回收比值满足具体的要求，所以最终选择薄膜过滤法作为该制剂微生物计数的方法。分析祛风活络喷雾剂的抑菌作用，其原料药物当归［11］、鸡血藤［12］、茜草［13-14］、五指毛桃［15］等在现代研究中均显示了对金黄色葡萄球菌的抑制作用；千斤拔［16］则被发现对白色念珠菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌等致病菌均有抑制作用；黑老虎［17］对枯草芽孢杆菌有一定抑制作用，推测祛风活络喷雾剂提取工艺可以提出原料药物的主要抑菌成分，使该制剂有一定的抑菌作用。

瑶医药是中华民族传统医药的一部分，在治疗风湿、类风湿等疾病方面有自己独特的优势，本研究中的祛风活络喷雾剂处方在临床使用三十多年，组方亦体现了瑶医学“风打”结合的特征，临床运用患者均反馈良好。本研究为该制剂的质量标准制定提供了依据，可用于该制剂的日常检验。