基于UHPLC-QTOF-MS/MS 技术分析玳玳花的化痰活性成分

曾文辉，龚千锋，杨民荣

1.江西省药品检查员中心，江西 南昌 330029；2.江西中医药大学，江西 南昌 330000；3.赣州市综合检验检测院食品药品检测所，江西 赣州 341000

近年来，药食两用资源被广泛地开发利用，传统入药的植物，随着研究的深入，也在某些功效上被加入到食品的目录中。玳玳花为芸香科植物玳玳花Citrus aurantium L.var.amaraEngl.（CALV）的花蕾［1］，具有理气宽胸，和胃止呕之功效。因其富含多种酚酸和黄酮成分［2］，可作茶饮以降糖、降脂等［3-4］。现代药理研究表明［5-7］，玳玳花无明显毒性并具有平喘祛痰、抗炎、抗氧化的作用。而对于化痰作用的有效成分却鲜有报道。超高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱(UHPLC-QTOF-MS/MS)技术可在较短时间内完成化学成分的分析，因此，本研究采用酚红祛痰法对玳玳花不同提取部位进行祛痰筛选，并采用UHPLC-QTOF-MS/MS 对有效部位进行成分鉴定，以期为相关研究提供科学依据。

1 仪器与试药

LC-30A 超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Triple-TOF 5600 高分辨质谱仪，配备ESI 离子源及Analyst 1.6 数据处理软件、Peak View 数据处理软件（美国AB SCIEX 公司）；HC-3018R 型高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；Millipore-Simplicity 超纯水处理系统（德国默克密理博公司），KQ-400DB 型超声清洗机（巩义市予华仪器有限责任公司），AL204 型电子分析天平［Mettler Toledo 仪器（上海）有限公司］。

对照品：咖啡酸（批号：110885-201703）、橙皮苷（批号：110721-202019）均购于中国食品药品检定研究院。隐绿原酸（批号：AKS-202015）、山柰酚-3-O-芸香糖苷（批号：AKS-202112）、芸香柚皮苷（批号: AKS-202005）、木犀草素-7-O-葡萄糖苷（批号: AKS-202024）、柚皮苷（批号：AKS-202113）均购于成都艾博克生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。本实验收集到的玳玳花干燥花序样品经江西中医药大学龚千锋教授鉴定为芸香科植物玳玳花。

2 方法

2.1 酚红祛痰法［8］

取昆明种小鼠 70 只［体重范围18～20 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2021-0002］，雄性，随机分为7 组，给药组分别灌胃玳玳花水提取物（2.826 g/kg）、80%乙醇提取物（2.826 g/kg）、石油醚部位（0.156 g/kg）、乙酸乙酯部位（0.148 g/kg）、正丁醇部位（0.788 g/kg）（注：玳玳花临床剂量为0.34 g/kg）。空白对照组给以CMCNa 溶液，阳性对照组给氯化铵（1 g/kg），每天 1 次，连续 7 d。末次给药前16 h 禁食不禁水，于末次给药30 min 后，腹腔注射0.2 ml 5% 酚红溶液，30 min 后剥离气管周围组织，剪下从甲状软骨下到气管分支处的一段气管，放至盛有2 mL 生理盐水的试管中，再加入1 mol/L NaOH 溶液0.1 mL，超声震荡10 min，以3 000 r/min 离心15 min，用酶标仪于波长559 nm 处测吸光度（A），用标准曲线法计算酚红排出量（μg/L）。

精密称取酚红12.5 mg，加5%碳酸氢钠溶液完全溶解后，转移至1 000 mL 容量瓶中，定容至刻度，配制成浓度为12.5 μg/mL 的酚红溶液，并用5%碳酸氢钠溶液等比稀释成浓度为 12.500、6.250、3.125、1.562、0.781、0.391、0.195 μg/mL 的酚红溶液，用酶标仪于559 nm 处测定吸光度值（A）。以浓度（C）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，绘制酚红标准曲线，线性回归方程为A=0.092 5C+0.007 6，r=0.999 8。酚红标准曲线见图1。

图1 酚红的标准曲线

2.2 色谱和质谱条件

2.2.1 液相条件采用岛津ARC-C18 色谱柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），流速为0.3 mL/min，梯度洗脱（0～2 min，B：5%；2～5 min，B：5% →9%；5～10 min，B：9% →15%；10～25 min，B：15% →20%；25～30 min，B：20%→25%；30～35 min，B：25%→75%；35～40 min，B：75% →5%；40～44 min，B：5%），柱温35 ℃，进样量1.0 μL。

2.2.2 质谱条件采用电喷雾电离源（ESI），负离子模式，质量扫描范围为m/z 80～1 200，喷雾电压：-4 500 V，雾化气温度：600 ℃，气帘气：172.36 kPa，雾化气和辅助气：344.74 kPa；去簇电压（DP）：-100 V；采用TOF-MS-IDA-MS/MS 方法采集数据，TOF/MS 一级预扫描和触发的二级扫描TOF/MS/MS 离子累积时间分别为500、200 ms，CE 碰撞能量为-32 eV。

2.3 对照品溶液的制备

精密取隐绿原酸、咖啡酸、山柰酚-3-O-芸香糖苷、芸香柚皮苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、柚皮甙、橙皮苷对照品适量，分别加甲醇配制成0.01 mg/mL 的溶液，备用。

2.4 供试品溶液的制备

取玳玳花乙醇提取物粉末0.1 g，精密称定，加入70%甲醇100 mL，超声，滤液置12 000 r/min 离心机中离心，过0.22 μm 滤微孔滤膜滤过，即得。

3 结果

3.1 祛痰结果

结果表明，玳玳花水提取物、80%乙醇提取物、乙酸乙酯部位和正丁醇部位给药后均能有效促进小鼠呼吸道酚红的分泌，与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.05 或P<0.01），而石油醚部位和空白组比较，差异无统计学意义（P>0.05），表1 和图2。由于乙醇提取物和正丁醇提取物都体现出促进酚红分泌的作用，但乙醇提取物富含的化合物比正丁醇多，因此着重研究乙醇提取物。

表1 玳玳花不同提取物对小鼠酚红排泌的影响（，n=10）

表1 玳玳花不同提取物对小鼠酚红排泌的影响（，n=10）

注：与空白组相比，a表示P<0.05，b表示P<0.01。

图2 玳玳花不同提取物对小鼠酚红排泌的影响

3.2 玳玳花的化学成分鉴定

用UHPLC-QTOF-MS/MS 对玳玳花成分进行定性分析，结果见图3 和表2。

表2 玳玳花乙醇提取物化学成分分析

图3 玳玳花乙醇提取物负离子模式的总离子流

经过Q-TOF-MS/MS 技术分析，初步鉴定了玳玳花中32 个化学成分，由化合物分离而言，多数为黄酮和有机酸类。化合物6 和9 经对照品比对后鉴定分别为隐绿原酸和咖啡酸，分别存在碎片离子m/z191 和135，这类碎片为奎宁酸及酰奎宁酸类的特征碎片，由此可推断鉴定化合物1、8、22、23分别为奎宁酸、异绿原酸B、异绿原酸A 和异绿原酸C；黄酮类成分主要为苷类和苷元，苷类化合物主要以葡萄糖、鼠李糖连接，而其他黄酮苷元（含失去糖基的）的特征碎片为m/z151，如化合物16、18、20、25、29 等化合物。

4 讨论

本研究采用小鼠酚红分泌实验研究玳玳花的祛痰作用，采用提取物及不同极性溶剂萃取而得不同部位的样品，共同筛选祛痰作用，结果发现乙醇提取物和正丁醇部位具有显著的祛痰作用。为了进一步探究玳玳花祛痰作用的化学成分，传统方法提取、分离、鉴定，所需材料和时间均耗费巨大，为了快速便捷弄清祛痰作用的化学成分，本研究采用高分辨质谱对玳玳花有效部位进行了成分鉴定。

液-质联用技术能够快速对复杂的化学成分体系进行分析，本研究建立了基于UHPLC-QTOFMS/MS 联用技术分析了玳玳花具有祛痰活性部位的化学成分，共鉴定成分32 个，主要为黄酮和酚酸类成分，其中7 个成分经对照品标定。酚酸类如咖啡酸、异绿原酸A、B、C 等，都具有抗炎、抗氧化的作用；黄酮类如橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷等，具有祛痰、止咳等作用［9-11］，这些成分都为玳玳花在抗氧化、祛痰等作用提供较好的物质基础。以药理筛选为导向，结合质谱分离分析技术鉴定对应的有效成分是研究中（成）药快速、可靠的方法。此次研究为玳玳花的化学成分的研究及评价其在祛痰方面的功效提供参考，并为玳玳花质量标准建立及药效机制研究提供数据支撑。