基于层次分析法优化祛风消痛喷雾剂的提取工艺

万春云，肖草茂，李玉云

1.江西省医疗器械检测中心，江西 南昌 330000；2.南昌医学院药学院，江西 南昌 330000

祛风消痛喷雾剂是由独活、羌活、细辛、三七、红花等13 味药材组成的一种外用制剂，具有祛风除湿，通血活络之功效。方中独活性温，入肾经，可散里之伏风，祛湿止痛，善行祛腰膝筋骨间风寒湿邪所致的下焦之病症，为君药，其主要成分为蛇床子素［1］。羌活辛温之品，具有祛风消肿止痛等功效，为臣药，研究表明，其发挥药效的有效成分是紫花前胡苷［2］。羌活、独活相须为用，祛风除湿，通络止痛力强，故有“羌活善治在上在表之游风，独活善治在下在里之伏风”之说。细辛味辛性温，具有解表散寒，祛风止痛等作用，为臣药，其主要成分是细辛脂素［1］。三七味甘性温，具有散瘀止血，消肿定痛等功效，人参皂苷Rg1 为其主要成分之一［1］。红花为活血行气之品，使气血运行通畅，达到活血通经散瘀之效，红花与三七同为佐药。羟基红花黄色素A 是其主要成分之一［1］。为更好地开发与推广该方剂，本研究以独活、羌活、细辛、三七、红花的有效成分转移率以及得膏率为评价指标，应用层次分析法确立权重系数，采用L9（34）正交试验优选祛风消痛喷雾剂的乙醇提取工艺，为祛风消痛喷雾剂的工业化生产提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LD-20AD 高效液相色谱仪（Shimadzu），ME5超微量电子天平（Sartorius），BT25S 电子天平（Sartorius）。

1.2 试药

蛇床子素对照品（批号110822-201710），紫花前胡苷对照品（批号111821-201604），细辛脂素对照品（批号111889-201705），人参皂苷Rg1对照品（批号110703-201933），羟基红花黄色素A 对照品（批号111637-201810），以上对照品均购自中国食品药品检定研究院。独活药材饮片、羌活药材饮片、细辛药材饮片、红花药材饮片、三七药材饮片均购自江西致和堂中药饮片有限公司，由江西省医疗器械检测中心李玉云研究员鉴定，均为正品。

2 方法与结果

2.1 祛风消痛喷雾剂各有效成分含量测定色谱条件及得膏率的测定方法

2.1.1 供试品的制备独活、三七粉碎成最粗粉，备用；羌活、细辛、红花直接采用饮片，备用。

2.1.2 蛇床子素含量测定色谱条件色谱柱为Welch Ultimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈-水（49∶51）；检测波长为330 nm；柱温25 ℃。

2.1.3 紫花前胡苷含量测定色谱条件［3］色谱柱为Welch Ultimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（40∶60），检测波长为334 nm，柱温为25 ℃。

2.1.4 细辛脂素含量测定色谱条件色谱柱为Welch Ultimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-水（B）梯度洗脱（0～20 min，50% A；20～26 min，50%→100% A）；检测波长为287 nm；柱温40 ℃。

2.1.5 人参皂苷Rg1 含量测定色谱条件色谱柱为Welch Ultimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-水（B）梯度洗脱（0～12 min，19% A；12～60 min，19%→36% A）；检测波长为203 nm；柱温25 ℃。

2.1.6 羟基红花黄色素A 含量测定色谱条件色谱柱为Welch Ultimate C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）；检测波长为403 nm；柱温25 ℃。

2.1.7 得膏率的测定精密量取各试验项下醇提液20 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，置105 ℃干燥箱中干燥至恒重，取出置干燥器内冷却30 min，迅速精密称定质量。计算浸膏得率。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇浓度考察按处方量称取独活、三七最粗粉，羌活、细辛、红花饮片4 份，分别加入不同浓度乙醇，8 倍溶剂量加热提取2 次，每次2 h，溶剂回收定容至100 mL。测定各乙醇浓度项下各药材有效成分的含量，并计算出各有效成分转移率及得膏率，结果见表1。根据试验结果，选择70%乙醇浓度进行后续考察。

表1 不同乙醇浓度各有效成分转移率及得膏率 %

2.2.2 料液比考察按处方量称取独活、三七最粗粉，羌活、细辛、红花饮片4 份，分别加入不同料液比的70%乙醇溶液为，加热提取2 次，每次2 h，溶剂回收定容至100 mL。测定各提取体积项下各药材有效成分的含量，并计算出各有效成分转移率及得膏率，结果见表2。根据试验结果，选择10 倍体积提取溶剂进行后续考察。

表2 不同料液比各有效成分转移率及得膏率 %

2.2.3 提取时间考察按处方量称取独活、三七最粗粉，羌活、细辛、红花饮片4 份，加入10 倍体积的70%乙醇溶液，加热提取2 次，分别提取1 h、2 h、3 h、4 h，溶剂回收定容至100 mL。测定各提取时间项下各药材有效成分的含量，并计算出各有效成分转移率及得膏率，结果见表3。根据试验结果，选择每次提取2 h 进行后续考察。

表3 不同提取时间各有效成分转移率及得膏率

2.2.4 提取次数考察按处方量称取独活、三七最粗粉，羌活、细辛、红花饮片3 份，加入10 倍体积的70%乙醇溶液，加热提取2 h，分别提取1 次、2 次、3 次。溶剂回收定容至100 mL。测定各提取次数项下各药材有效成分的含量，并计算出各有效成分转移率及得膏率，结果见表4。根据试验结果，选择提取2 次进行后续考察。

表4 不同提取次数各有效成分转移率及得膏率 %

2.3 层次分析法确定综合评分权重系数

层次分析法（analytic hierarchy process，AHP）是一种通过两两比较来判断各目标优先次序的矩阵，将人为赋分结果和客观验证结果有效地结合起来的方法［4］。基于中药复方的君臣佐使配伍关系及各起效成分配伍强弱，确定各成分的优先顺序：独活>羌活=细辛>三七=红花>得膏率，以独活、羌活、三七、细辛、红花的主要有效成分含量及得膏率为测定指标进行评价，计算各综合评分，构建成对比较的判断优先矩阵，赋予各项指标间的相对评分，见表5。

表5 6项目标成对比较判断优先矩阵 分

在各项指标两两比较判断矩阵中，各药材的有效成分相对得膏率重要得多，因为它是发挥临床药效的物质基础。在处方中独活为君药，羌活与细辛为臣药，红花和三七为佐药，独活有效成分蛇床子素相对羌活有效成分紫花前胡苷及细辛有效成分细辛脂素重要，记2 分，相对红花有效成分羟基红花黄色素A 及三七有效成分人参皂苷Rg1更重要，记3 分，相对得膏率记4 分，其余以此类推。

式中，RI为判断矩阵的平均随机一致性指标，查找相应的平均随机一致性指标，当矩阵阶数为6时，RI＝1.24［6］。

由计算结果可知，蛇床子素的权重系数为0.342 9、细辛脂素、紫花前胡苷的权重系数为0.171 4、羟基红花黄色素A、人参皂苷Rg1的权重系数为0.114 3，得膏率的权重系数为0.085 7。其中，CR作为衡量所得权重系数是否合理的指标，由表6 可知，CR<0.1，即认为判断矩阵具有满意的一致性，说明所求得的权重系数合理有效，它可用在下一步祛风消痛喷雾剂提取工艺优选的综合评分中。

表6 指标性成分权重系数及一致性检验

2.4 提取工艺优选

根据对上述单因素考察结果的分析，以影响醇提工艺主要因素乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取次数（D）为考察因素，以各药材有效成分转移率及得膏率的总得分为评价指标，通过4 因素3 水平的正交试验L9（34）进一步研究提取最佳条件。正交因素水平表见表7。按设计的正交试验表进行试验，测定各药材有效成分的转移率及得膏率，并根据“2.3”项下基于AHP 确立的Wi分别计算出各正交试验的总得分，总得分（M）=0.342 9×蛇床子素转移率+0.171 4×细辛脂素转移率+0.171 4×紫花前胡苷转移率+0.114 3×羟基红花黄色素A 转移率+0.114 3×人参皂苷Rg1转移率+0.085 7×得膏率，正交试验结果见表8。

表7 L9（34）正交试验因素水平表

表8 正交试验各成分转移率及综合评分结果

对上述正交实验结果进行直观分析和方差分析，最佳提取工艺为A2B2C2D3，料液比（R 值最小）作为方差分析误差项，结果显示，各因素影响差异无统计学意义。见表9。

表9 正交试验的方差分析

2.5 验证试验

为验证祛风消痛喷雾剂提取工艺的稳定性，对优选出的提取条件A2B2C2D3 进行验证试验，结果显示，3 组验证实验总得分的RSD 为2.33%，表明该提取工艺稳定可靠，可用于工业生产。结果见表10。

表10 工艺验证试验转移率和综合评分结果

3 讨论

三七属于贵重药材，其质坚硬，不粉碎难以提取有效成分，因此在单因素考察过程中采用最粗粉，但提取转移率未达到80%以上，后续特对三七粉碎粒度进行了考察。参照上述醇提因素，以三七最粗粉、粗粉、中粉粒度考察，检测其人参皂苷Rg1，结果表明三种粉碎粒度转移率基本接近，三七粉碎度对提取转移率无明显影响，因此，在本处方提取过程中，选用三七最粗粉即可。羌活中异欧前胡素加热提取后，含量明显下降，是因为异欧前胡素在加热回流过程中，在酸性条件下发生了麦氏重排，转变了结构接近的其他香豆素类成分［7］，经过查阅文献，紫花前胡苷为香豆素成分，具有镇痛作用，因此提取工艺中采用紫花前胡苷转移率作为指标成分之一。

本研究在单因素试验的基础上，以提取影响较大的四个因素乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数进行正交试验考察，根据该制剂的特点及临床疗效，以祛风消痛喷雾剂处方中的独活、羌活、细辛、三七、红花的主要有效成分含量及得膏率为评价指标，结合该方中君臣佐使配伍关系，根据各药材间的重要性差异确定其有效成分的权重系数，采用正交试验结合层次分析法，对祛风消痛喷雾剂的提取条件进行了研究，确定最佳提取条件，即加入10 倍体积的70%乙醇提取，提取3 次，每次1.5 h，提高了处方中各药材有效成分的含量，并就此工艺参数进行了试验验证，结果表明基于AHP 确立的提取工艺稳定、可靠，有效成分提取完全，应用层次评分法进行评价，更客观、科学地评价祛风消痛喷雾剂的提取工艺。需要特别指出的是，乙醇提取之后细辛脂素转移率超过100%，是由于在加热回流过程中，甲基丁香酚等有毒成分有可能转换成细辛脂素，且有研究报道，加热时间越长，越有助于细辛脂素的溶出［8-9］，因此细辛久煎后细辛脂素含量显著增大。