树突状细胞瘤苗预防接种联合吉西他滨治疗可提高胰腺癌小鼠模型的生存率

河北医科大学第四医院生物治疗科 汪治宇 王聪敏 王 娟

引言

胰腺癌是西方世界第五大致死性癌症，其5年总生存率小于5%[1]。胰十二指肠切除术是治愈胰腺癌唯一的手段，但确诊患者中只有10%～15% 适合手术治疗。应用吉西他滨化疗是目前治疗晚期胰腺癌最有效的方法，其生存率相较于应用5-氟尿嘧啶(5-FU)治疗有中度升高[2,3]。近来实验中尚无证据表明吉西他滨联合其他化疗药物可提高生存率[4]，因此我们需要找寻治疗晚期胰腺癌的新策略。胰腺癌细胞可以被肿瘤特异性T细胞识别[3-6]，而且肿瘤被细胞毒性T细胞(CTLs)及辅助性T细胞浸润是胰腺癌病人良好的预后因素[7]。可抑制肿瘤的肿瘤反应性T细胞也可以从胰腺癌患者血液中分离出来[8]。

树突状细胞(DCs)瘤苗接种可激活肿瘤特异性T细胞[9,10]。DCs是具有独特的建立初级免疫反应能力的专门的抗原提呈细胞[11]。DCs可将外源性抗原呈递给主要组织相容性复合体Ⅰ(MHCⅠ)，进而形成激活CTLs的通路，这个过程称为“交叉递呈”[12]。接触微生物的或炎性“危险信号”也可以像接触T细胞源性激活信号那样诱导DC成熟及白介素(IL)12分泌[13,14]。IL-12在调节肿瘤定向免疫反应及通过激发自然杀伤(NK)细胞、CTLs及干扰素(IFN)γ来产生1型辅助性T细胞(Th1)的过程中起中心作用。接种负载肿瘤抗原的DCs瘤苗已被证实可以诱导体内抗肿瘤的CTL反应，并且可诱发癌症病人的肿瘤缩小[9,15-17]。接种负载肿瘤抗原的DCs瘤苗后，胰腺癌细胞在体内会被排斥[18,19]，然而肿瘤能够在其周围构建一个对CTLs不敏感的免疫抑制环境。与其他治疗策略如放化疗联合可打破癌细胞的免疫抵抗并可增强DC瘤苗接种的疗效。

吉西他滨不仅发挥直接的抗肿瘤活性，还可以介导与肿瘤免疫治疗相关的免疫学效应[20-22]。经吉西他滨在内的多种药物治疗后，CTL反应也可通过DCs交叉递呈肿瘤细胞抗原而诱发[23]。吉西他滨治疗可促进DCs对肿瘤抗原的交叉递呈，这也提高了体内CTLs对肿瘤的识别能力[24]。近来，我们证实了吉西他滨可增加人类胰腺癌细胞对DC诱导的肿瘤特异性CTL反应的敏感性[25]。本实验中，我们应用胰腺癌小鼠模型来研究吉西他滨是否可以提高树突状细胞瘤苗体内接种的疗效。

1 材料与方法

1.1 小鼠，细胞株和培养液

动物实验由德国慕尼黑Regierung von Oberbayern批准。C57BL/6小鼠来自Harlan Winkelmann(博尔兴，德国)。C57BL/6背景的转基因OT-1动物由Brocker 教授提供(慕尼黑大学免疫学系)。OT-1 T细胞生长于含10%胎牛血清(FCS;Gibco,Invitrogen公司，Paisley，英国)、青霉素及链霉素的RPMI培养液(Biochrome，柏林，德国)中。H2-b阳性细胞株PancO2来源于C57BL/6 小鼠体内被甲基苯蒽诱发的胰腺癌[26,27]。PancO2细胞保存在含10%FCS、2mML-谷氨酰胺(生命技术公司，Paisley，英国)、100U/ml青霉素(Sigma，慕尼黑，德国)及100μg/ml链霉素(Seromed,Julich,德国)的RPMI培养液中。在与DCs共同培养之前，PancO2已被紫外线B以0.75J/cm2的强度照射过。经紫外线照射后仍存活的肿瘤细胞通过光学显微镜及胸苷掺入法被排除。H2-Kb阳性淋巴细胞株EL4(由Enders教授，Institut fur Chirurgische Forschung，慕尼黑大学，惠赠)保存在含10%FCS、青霉素及链霉素的DMEM培养液中。

1.2 mRNA提取及反转录PCR

标本先在磷酸缓冲液(PBS)中清洗，然后在液氮中冰冻切片并储存在-70℃的环境中。采用均质匀浆仪(Janke und Kunkel，施陶芬，德国)对组织进行均匀退火，然后应用罗氏总RNA组织提取试剂盒(罗氏，曼海姆，德国)分离总RNA。RNA储存于等容量的酒精中并置于－80℃的环境中。通过光谱分析检测RNA的收率及纯度。反转录运用了M-MLV反转录酶(Gibco 生命技术公司，Paisley，英国)、RNA酶抑制剂(罗氏，曼海姆，德国)以及dNTP(Promega，麦迪逊，德国)。PCR应用了Taq DNA聚合酶并按照供应商(罗氏，曼海姆，德国)推荐的方式进行。引物采用Applied Biosystems(Weiterstadt，德国)根据文献提供的序列研制而成[28]。

1.3 单克隆抗体及流式细胞术

为进行表型分析，DCs与5μg/2×105细胞抗小鼠CD86-FITC单克隆抗体(mAb；克隆GL1)、CD11b-PerCP mAb(克隆 M1/70)、CD11c-APC mAb(克隆HL3；全部来自BD Biosciences公司，SanJose，认证中心，美国)、MHCⅡ-PE mAb(克隆 NIMR-4，南方生物技术公司，伯明翰，AL，美国)以及合适的同型对照一起在4℃的环境中培养30min。细胞采用流式细胞术(FACSCalibur，BD Biosciences，海德尔堡，德国)检验。应用CellQuest软件(BD Biosciences，海德尔堡，德国)分析数据。应用抗小鼠mAb(H2-Kb，克隆AF6-88.5；和H2-Db，克隆KH95，二者均来自BD Biosciences，San Jose，CA，美国)检测MHCⅠ的表达。

1.4 肽

H2-Kb限制性抗原肽OVA257-264、TRP2181-188以及p15E604-611均来自Peptide Technologies(柏林，德国)[29-31]。

1.5 试剂

吉西他滨来自Lilly(Indianapolis，IN，美国)。咪达唑仑(Roche，巴塞尔，瑞士)，medetomidin(Orion公司，Espoo，芬兰)，芬太尼(Janssen-Cilag，诺伊斯，德国)以及纳洛酮(Deltaselect，Dreieich，德国)被用来麻醉。

1.6 细胞因子、生长因子、刺激剂和ELISAs

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IFNγ、IL-1β、IL-2以及IL-4来自PeproTech(伦敦，英国)，IFNα来自HyCult Biotechnology(Uden，荷兰)。内毒素(LPS)，p:IC，R848和肿瘤坏死因子α(TNFα)均来自Sigma-Aldrich(Steinheim，德国)。IL-12p70、IL-12p40和IFNγ的小鼠ELISA试剂盒均来自BD Biosciences(San Diego，CA，美国)。

1.7 骨髓源性DCs的生成及其抗原负载

如述制备骨髓源性DCs[32]。骨髓细胞采集自小鼠的股骨和胫骨。将红细胞溶解于氯化铵缓冲液(BD Biosciences，海德尔堡，德国)。细胞以5×105个/cm2的密度培养于RPMI 1640培养液中，并向培养液中加入10%FCS、2mM L-谷氨酰胺、100μg/ml链霉素、1IU/ml青霉素、20ng/ml GM-CSF以及20ng/ml IL-4(DC培养液)。7天后可获得粘连松散的细胞，通过荧光激活细胞分选器(FACS)对DC标记的表达进行量化。DCs占制备细胞的70%。以DC/肿瘤细胞比值为10:1的比例将DCs与PancO2(后文被称作“激发”)细胞共同培养，最后24h加入LPS(250ng/ml)和IFNγ(100ng/ml)。九天后可-获得粘连松散的细胞，冲洗后置于RPMI中再悬浮并通过FACS进行分析。

1.8 肿瘤诱发及瘤苗接种策略

作为预防性接种，最终容积为200μl含3×105DCs的RPMI从小鼠右胁腹经皮下注射，对侧胁腹皮下注射PancO2(1×106于200μlRPMI)，以使小鼠受到肿瘤威胁。治疗性接种在肿瘤形成可触性结节后开始进行。吉西他滨以25或50mg每公斤体重腹腔内给药，每周2次。肿瘤生长以直径的乘积表示。当肿瘤的大小超过400mm2或观察到动物的窘迫征象在48h内加倍时动物将被处死。为了原位肿瘤更好发展，在麻醉状态下切开小鼠的左胁腹，移除脾脏以接纳胰腺。总量达2×105PancO2细胞被注射入胰腺。通过LaThetaTM型小型动物体内CT扫描仪(Zinsser Analytic)来监测肿瘤的生长。动物CT扫描是在Heinz-Peter Scheuber教授(TierschutzInformationsZentrum for生物医学研究所，慕尼黑大学)与Adam Glowalla(Zinsser Analytic，德国)的协助下进行的。

1.9 体内细胞毒性检测

检测通过将羧基荧光素双乙酸-琥珀酰亚胺酯(CFSEhigh，2μM；CFSElow， 0.2μM)标记的C57BL/6淋巴细胞导入接种了或未进行接种的小鼠来进行。CFSEhigh标记的细胞由p15E肽(2μg/ml)来刺激，而CFSElow标记的细胞则未被刺激。靶细胞注入20h后，将CFSEhigh及CFSElow标记的细胞以1:1的比例经腹腔注入，移除脾脏，CFSEhigh与CFSElow细胞的比值由流式细胞术决定。细胞毒性通过以下公式计算：接种小鼠：CFSEhigh/CFSElow；未接种小鼠：CFSEhigh/CFSElow。

图1 骨髓源性DCs能够摄取肿瘤抗原，并且可以在LPS及IFNγ的刺激下分泌IL-12p70。DCs来源于与粒-巨细胞集落刺激因子和IL-4共同培养的C57BL/6小鼠骨髓。在培养的第6天，将DCs与经紫外线照射的CFSE标记的PancO2细胞以10:1的比例共同孵育。CD11c+DCs对肿瘤细胞的摄取通过FACS分析测定(A所示为5组FACS分析中有代表性的一组结果)。在培养的第6天，用不同的刺激来激发DCs，持续24h。用ELISA分析所获上清液中IL-12的产量。[B所示数据为两次独立实验的平均值(SEM)]

1.10 体外细胞毒性测定

我们在慕尼黑大学免疫学系的R Wank教授的协助下进行了51铬释放检测。首先在37℃的环境中，将靶细胞在Na251CrO4(100μCi/106靶细胞)溶液中孵育1h，然后将细胞冲洗3遍，再与效应细胞共同培养于96孔圆底培养板上(5×103/孔)，总体积为200μl。在37℃的环境中孵育4h后，获得50μl上清液，应用伽马计数器(Wallac Oy，土尔库，芬兰)检测其放射性。通过以2.5%的最终浓度与曲通X-100络合体系(Sigma，慕尼黑，德国)共同培养来评估最大释放量。在不存在效应细胞的情况下测定自发性释放量。根据以下公式计算特异性杀伤性：特异性51Cr释放=[(实验计数-自发性计数)/(最大计数-自发计数)]×100%。

1.11 统计学方法

采用司徒登氏t测验来显示在肿瘤防护上的显著差异。我们比较了对照组动物及所有经过处理的动物(包括无肿瘤及肿瘤阳性的动物)的肿瘤大小。–应用Cox比例风险模型分析Kaplan-Meier生存曲线。

2 结果

2.1 接种经PancO2激发的DCs可抑制皮下肿瘤的发展

图2 预防性接种PancO2激发的DCs瘤苗可全面阻止皮下PancO2肿瘤的发展。年龄为6～10周的雌性C57BL/6小鼠分别作如下处理：皮下接种PancO2激发的同系DCs(3×105)，或未被激发的同系DCs(3×105)，或经紫外线照射的PancO2细胞(1×105)，以上均为每隔一周注射3次，或不作处理。最后一次接种后的第7天，所有小鼠均接受1×106PancO2细胞皮下注射。定期检测肿瘤的生长，肿瘤大小以直径之积来检测(A所示数据未每组中3只动物的平均值(SEM))。在平行实验中，各组小鼠均在两次接种后被处死，淋巴细胞的体外INFγ产量通过ELISA来检测[B所示数据未每组中两只动物的平均值(SEM)]。AG：抗原。

我们前期曾提出经紫外线照射而凋亡的肿瘤细胞激发的DCs在启动抗人胰腺癌细胞CTLs方面优于肿瘤溶解产物激发的DC[33]，此发现近期已在PancO2肿瘤模型中被证实[34]。因此，我们选择经紫外线照射的PancO2细胞作为肿瘤抗原的来源。骨髓源性DCs能够摄取死亡的PancO2细胞，并且可以在LPS及IFNγ的刺激下分泌IL-12p70(图1)。经三次PancO2激发的DCs瘤苗接种可完全阻止小鼠肿瘤的发展(图2A)。未经处理的小鼠的肿瘤可在35天之内发展至平均大小为110mm2(图2B)。只有仅接受经紫外线照射的PancO2细胞或接受未负载的DCs的小鼠的肿瘤会中度缩小(即35天后肿瘤平均大小约为44mm2)。接种了PancO2激发的DCs瘤苗的小鼠的肿瘤防护与经两次接种后孤立淋巴细胞高水平分泌IFNγ有关(图2B)。

图3 预防性接种PancO2激发的DCs诱导与长期肿瘤防护相关的免疫记忆。年龄为6～10周的雌性C57BL/6小鼠分别作如下处理：皮下接种PancO2激发的同系DCs(3×105)，或未被激发的同系DCs(3×105)，或经紫外线照射的PancO2细胞(1×105)，以上均为每隔一周注射3次，或不作处理。最后一次接种后的第7天，所有小鼠均接受1×106PancO2细胞皮下注射。定期检测肿瘤的生长，肿瘤大小以直径之积来检测。接受DC瘤苗接种的小鼠仍保持无瘤状态，并在初始肿瘤接种后的第95天再次皮下注射1×106PancO2肿瘤细胞。事先未经处理的小鼠充当对照组[图所示数据未每组中3只动物的平均值(SEM)]。AG：抗原。

2.2 接种经PancO2激发的DCs可建立免疫记忆及长期肿瘤防护

受到PancO2细胞威胁的对照组动物在40～50天后死亡，而预防性接种了PancO2激发的DCs瘤苗的小鼠可无瘤生存3个月以上。这些小鼠在第一次肿瘤威胁95天后再次受到PancO2细胞的攻击。如图3所示，相较于对照组迅速长大的肿瘤(第26天肿瘤平均大小为91mm2)，接种瘤苗的小鼠仍然可以抵抗肿瘤发展。接种瘤苗的小鼠在第95天再次受到PancO2攻击，但仍可长期存活且数月后仍没有局部或系统性肿瘤生长，最终对其施以安乐死。

2.3 接种经PancO2激发的DCs可诱导肿瘤特异性CTLs

尽管小鼠肿瘤的发展可以对抗，DC瘤苗接种诱导肿瘤特异性CTL反应仍有待于证实。病毒相关性的小鼠白血病病毒(MuLV)env-蛋白由gp70基因编码并由小鼠癌细胞选择性表达。图4A表明gp70 mRNA表达于来源于Balb/C小鼠的PancO2及C26结肠癌细胞，但不表达于正常组织。将负载MuLV env-蛋白源性p15E肽的来源于Balb/C小鼠的CFSEhigh标记的淋巴细胞及CFSElow标记的、未负载的淋巴细胞注入接种了三次PancO2激发的DCs瘤苗或未作处理的小鼠的尾静脉。相较于未处理的动物，通过使接种过的动物的p12E负载的CFSEhigh淋巴细胞达标，可算得约12%的特异性杀伤率(图4B)。因此，PancO2负载的DCs不仅可对抗肿瘤发展，还能够诱导免疫记忆及肿瘤特异性CTL反应。

图4 接种PancO2激发的DCs可诱导肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)。H2-kb-限制性肽p15E来源于病毒相关的gp70基因所编码的小鼠白血病env蛋白。gp70 mRNA的表达可在PancO2细胞、C26克隆癌细胞(来源于Balb/c小鼠品系)以及C57BL/6小鼠的肝脏、脾脏、胰腺及淋巴结的标本中检测到(A)。为了检测体内p15E特异性CTLs，将负载p15E肽的来源于Balb/C小鼠的CFSEhigh标记的淋巴细胞及CFSElow标记的、未负载的淋巴细胞注入接种了三次PancO2激发的DCs瘤苗或未作处理的小鼠的尾静脉。20小时后，移除脾脏，通过流式细胞术检测不同标记的淋巴细胞的频度。通过使接种过的动物的p12E负载的CFSEhigh淋巴细胞相较于未经处理动物的相对减少量达标来检测特异性杀伤(B所示数据未4个独立实验的平均值(SEM))。

2.4 肿瘤特异性CTLs可识别并杀伤PancO2细胞

与人类胰腺癌相似，PancO2源性肿瘤是弱免疫原性的。而且，PancO2细胞仅低水平表达经典CTL介导的杀伤所需的MHCⅠ(数据未显示)。因此，我们在将PancO2细胞应用于体内治疗性接种模型前先分析了其在体外能否被抗原特异性CTLs识别。我们应用了特异性针对OVA表位SIINFEKL的来源于转基因OT-1动物的CTLs[35,36]。在51Cr释放检验中，负载SIINFEKL肽或者不相关对照肽的PancO2细胞与来源于野生型小鼠或OT-1小鼠的淋巴细胞共同培养。负载SIINFEKL肽或者不相关肽的EL4细胞被用作对照目标。负载SIINFEKL的PancO2细胞可被转基因OT-1小鼠源性淋巴细胞特异性杀伤(见图5)。

2.5 DC瘤苗接种联合吉西他滨可提高PancO2胰腺癌模型的生存率

图5 PancO2细胞可被抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞以MHCⅠ限制性的方式识别并杀伤。在51Cr释放检验中，负载SIINFEKL肽或者不相关对照肽的PancO2细胞与来源于野生型C57B/6小鼠或OT-1小鼠的淋巴细胞共同培养，效应子与目标子的比值从3.125:1到100:1，负载SIINFEKL肽或者不相关肽的EL4细胞与来源于转基因OT-1小鼠的淋巴细胞共同培养，被用作阳性对照。

注入PancO2细胞后的第14天，我们建立了4个肿瘤大小相当(约13mm2)的实验组。对各组小鼠分别进行如下处理：不作处理(对照)，PancO2激发的DCs(DC)，吉西他滨(Gem)和PancO2激发的DCs加吉西他滨(DC+Gem)。吉西他滨每周给2次药，50mg/kg，在联合治疗方案中，则分别在接种DCs前后两天给药。治疗共持续5周。如图6A所示，治疗开始后第58天，对照组动物已全部死亡，单独DC瘤苗接种与吉西他滨治疗在预防死亡方面效果相当(治疗第58天生存率分别为14%和17%；DC接种对对照组和吉西他滨对对照组P分别为0.13和0.08)。与每种治疗策略单独应用相比，联合治疗方案可使生存率显著提高(治疗第58天生存率为50%；联合治疗对对照组P＜0.005)。在所有治疗组中局部肿瘤生长均受到抑制，在治疗开始后第32天时，对照组、DC接种组、吉西他滨组及联合治疗组的肿瘤平均大小分别为：123mm2、91mm2、85mm2和67mm2。但是，在于对照组比较时，这些结果均未达到统计学意义(见图6B)。DC瘤苗接种加吉西他滨治疗使动物生存率升高不仅仅是相加效应，而且吉西他滨单独治疗不足以显著提高生存率或抑制局部肿瘤生长，因此，我们推测吉西他滨治疗与DC瘤苗接种之间存在着独立于药物直接的细胞毒性效应之外的协同作用。为了验证此假设，我们将吉西他滨剂量减半并重复了该实验。如图7所示，剂量为50mg/kg和25mg/kg的吉西他滨联合DC瘤苗接种均可提高带PancO2肿瘤小鼠的生存率(DC+吉西他滨50mg/kg对对照组P=0.01；DC+吉西他滨25mg/kg对对照组P=0.001)。如前，两种治疗策略单独应用均不足以显著提高生存率(DC瘤苗接种单独治疗对对照组P=0.98；吉西他滨单独治疗对对照组P=0.18)。

图6 DC瘤苗接种联合吉西他滨治疗可提高皮下PancO2小鼠胰腺癌模型的生存率。将0.5×106PancO2细胞经皮下注射入年龄为6到10周的雌性C57BL/6小鼠体内。在肿瘤接种后的第14天，我们建立了4个实验组。对各组小鼠分别进行如下处理：不作处理(n=5；对照)，隔周接种PancO2激发的DCs瘤苗(n=7；DC)，每周两次腹腔内注射吉西他滨(50mg/kg体重)(n=6；Gem)以及PancO2激发的DCs联合吉西他滨(n=6；DC+Gem)。治疗共持续5周。以Kaplan-Meier图表来描述各组的生存率(A)。定期检测肿瘤的生长，肿瘤大小以直径之积来检测(B)。图所示数据为各组动物相关数据的平均值(SEM)。

2.6 接种PancO2激发的DCs瘤苗可预防肿瘤转移及原位生长

对未经处理或已接种3次PancO2激发的DCs瘤苗的小鼠，于末次接种后的第7天，经尾静脉注入25×104PancO2细胞。如图8A所示，未经处理的小鼠60天内全部死亡，相反，此模型中PancO2激发的DCs瘤苗防止了死亡发生。组织病理学分析证实了未经处理的小鼠肺内存在肿瘤细胞(图8B)。我们在一个原位肿瘤模型中检测了DC瘤苗接种抑制局部肿瘤生长的能力。一组小鼠不作处理，另一组小鼠经皮下接种3×105负载PancO2的DCs。最后一次接种后的第7天，如材料及方法部分所述，将2×105PancO2细胞注射入胰腺。诱瘤后的第19天，切除肉眼可见的肿瘤并对其进行评估。对照组中，肿瘤体积约达400mm2，平均重量为400mg(图9，左)；而预防性接种PancO2负载的DCs完全阻止了原位PancO2肿瘤的生长(DC接种对对照组P=0.014)。一台试验用小型动物CT扫描仪被用来监测一些动物体内肿瘤的生长。胰腺内注射PancO2细胞3周后，未经处理的动物的肿瘤直径约达1cm(图9；右侧，上方)。

3 讨论

本实验中我们首次证实了DC瘤苗接种可联合吉西他滨来提高胰腺癌小鼠模型的生存率，此外，我们还证实了预防性接种DC瘤苗可预防小鼠PancO2胰腺癌细胞的转移和原位生长。我们选择PancO2小鼠肿瘤模型因为其弱免疫原性是类似于人类胰腺癌的典型特征之一[37]。然而，尽管MHCⅠ低水平表达，PancO2细胞仍可被CTLs识别并杀伤，而且免疫治疗方法在此模型中行之有效[27,28]。首先，我们证实了PancO2诱发的DCs可建立与长期肿瘤防护有关的免疫记忆并能够诱导肿瘤特异性CTL反应。值得注意的是，具有体内细胞溶解能力的肽特异性CTLs负载于多克隆全细胞抗原制剂的DCs诱导。肿瘤的CTLs浸润有利于胰腺癌及其他实体癌的预后[7,39]。我们尚无法通过组织病理学检测DC瘤苗接种后T细胞浸润的增加，同时在治疗性皮下模型上肿瘤大小缩小并不显著。然而，我们的数据显示DC瘤苗接种可以预防肿瘤经血液播散所致的死亡以及抑制肺转移的形成。这与在B16小鼠黑色素瘤模型上的发现相一致：尽管瘤苗接种治疗无法阻止B16小鼠黑色素瘤的局部生长，但其在抗肺转移性疾病方面仍然有效[30,40]。

图9 预防性接种负载PancO2的DCs瘤苗可阻止原位肿瘤的生长。一组小鼠不作处理，另一组小鼠经皮下接种3×105负载PancO2的DCs。最后一次接种后的第7天，开腹切除脾脏并将2×105PancO2细胞注射入胰腺。手术后的第19天，切除肿瘤并称重(左，数据为各组的平均值(SEM))。用CT扫描来监测一些动物体内原位肿瘤的生长。胰腺内注射PancO2细胞19天后未经处理的对照动物(右，上)及接种瘤苗动物(右，下)的典型腹部CT扫描如图所示。

尽管全部负载异位PancO2肿瘤的小鼠最终均死于该病，但其中一些仍在负载着相当大的皮下肿瘤的情况下生存了很长时间。相反的，负载原位肿瘤的小鼠则在腹腔转移形成后迅速死于消耗综合征。重要的是，预防性皮下DC瘤苗接种完全阻止了原位肿瘤的生长。所以，DC瘤苗接种诱导的系统免疫反应能够抑制腹腔内肿瘤生长。尽管Takigawa等人之前在胰腺癌仓鼠模型上已证实腹腔内注射肿瘤溶解产物激发的DCs可以抑制原位肿瘤的腹腔内播散[41]，这仍是一个重要的新发现。尽管尚未被正式地验证，但似乎DC瘤苗接种所诱导的循环的肿瘤特异性CTLs能够进入腹腔，从而识别并杀死肿瘤细胞。因此，辅助性DC瘤苗接种对于预防胰腺癌病人胰腺十二指肠切除术后浸润的或局部残留的肿瘤细胞所致的肿瘤复发可能有效。尽管DC瘤苗接种与吉西他滨在治疗组效果相当，但二者均既不能阻止已建立的肿瘤的进展，也不能显著降低死亡率。众所周知，PancO2细胞对化疗相对耐药，而瘤苗接种无效则可能由于肿瘤所致的免疫抑制环境(如，对T细胞介导的免疫不利的可溶性因子如IL-10或转化生长因子(TGF)β的分泌)，效应细胞接触肿瘤组织受限或者肿瘤浸润的淋巴细胞失活，这也是其另一个与人类胰腺癌相似的特征[7,42]。如果联合DC瘤苗接种和吉西他滨，带瘤小鼠的生存率会显著提高。这与之前发现的吉西他滨可提高体内CD40配基化所激发的免疫的效果[24]相一致。在我们的模型上吉西他滨提高DC瘤苗接种效果的确切机制尚不清楚。在一个人类体外模型中，我们证实了药物可以增加胰腺癌细胞对CTL反应的敏感性[25]。其他人已证实吉西他滨诱导的凋亡可增加肿瘤内DCs向CTLs交叉递呈肿瘤抗原[24]。化疗所致的免疫抑制可能会限制其与肿瘤的免疫治疗方法的联合。尽管有报道称在动物模型中吉西他滨可抑制B细胞介导的免疫反应[43]，但它仍可用于胰腺癌患者而不会导致T细胞和DC功能的相关缺失[22]。此外，初步数据显示吉西他滨甚至可以抑制Th2及特异性扩大癌症患者体内的Th1型免疫反应[22]。吉西他滨在局部肿瘤环境上的治疗效果以及肿瘤抗原特异性的CTLs的频率和作用目前仍在研究中。

尽管临床试验已证实DC瘤苗接种可规律性的建立肿瘤特异性免疫，但显然消化道恶性肿瘤患者对免疫治疗的临床反应却微乎其微[12]。目前，研究人员正在试图找寻有助于克服肿瘤免疫抑制且不干扰肿瘤直接免疫反应激活的策略。越来越多的证据提示已经较成熟的治疗策略如放疗、外科缩瘤术及化疗可以成功地联合免疫治疗的方法[44-46]。吉西他滨目前用于治疗不可切除的胰腺癌且不会导致免疫抑制。本实验中，我们在胰腺癌小鼠模型上证实了联合吉西他滨可扩大DC瘤苗接种的疗效。基于此发现，我们机构启动了研究吉西他滨联合自体DC瘤苗治疗晚期胰腺癌的Ⅱ期试验。

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