Endoglin基因敲除鼠饲养繁殖及基因鉴定*

许丹丹，汪佳佳，郭 霜，张飞雪，刘秀芬**

(1.湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室)

膜内皮蛋白(endoglin)又称CD105，是一种跨膜糖蛋白，对维持血管内皮的正常功能至关重要，它也是转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)超家族的Ⅲ型辅助受体。根据目前的研究分析，endoglin可能成为诊断心血管疾病的有效标志物以及预防治疗心血管疾病的潜在靶点[1]。在妊娠中期，endoglin-null老鼠死于血管生成缺陷和严重心血管异常,而endoglin杂合子(endoglin+/-)的小鼠有一个正常的寿命[2]。基于此，我们制作了endoglin基因敲除杂合子小鼠，为心血管疾病的研究提供动物疾病模型。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

CD105单克隆抗体购自美国CST公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体购自武汉谷歌公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG购自Biosharp公司；RIPA组织裂解液(RIPA)购自美国CST公司；二喹啉甲(BCA)蛋白浓度检测试剂盒购自南京诺唯赞生物技术有限公司；苯甲基磺酰氟(PMSF)购自碧云天公司；蛋白酶抑制剂购自美国Thermo Fisher公司；超敏型化学发光(ECL)显影液购自武汉爱博泰克公司；PCR仪、Universal HoodⅡ-凝胶成像系统和PowerPac Basic垂直电泳仪购自美国Bio-Rad公司；低温高速离心机购自德国Eppendorf公司；多功能酶标仪购自美国BioTek公司。

1.2 小鼠的饲养与繁殖

Endoglin+/-小鼠由北京维通达生物技术有限公司制作，在湖北科技学院医药研究院SPF动物房中繁殖扩群。屏障内环境均符合国家对实验动物环境设施的要求：温度(23±3)℃，相对湿度(50±15)%。在饲养过程中，垫料、笼等器具均进行高压真空灭菌；为了避免高温高压对饲料营养的损伤，本实验采用钴60辐射消毒饲料；饮水经高压达到纯净无菌要求，小鼠自由饮水；为保证小鼠居住环境的洁净度，垫料48h更换一次。最初引进10只雌性和6只雄性endoglin+/-小鼠，母鼠妊娠期为21d左右，和正常小鼠妊娠期一致。哺乳期为28～30d，幼鼠在约1个月断奶后打耳号标记并剪尾鉴定。性成熟期为60d左右，大量繁殖时采用两只雌鼠和一只雄鼠合笼。

1.3 小鼠的基因型鉴定

引进小鼠均为endoglin+/-小鼠，根据孟德尔遗传定律，配对繁殖的后代有3种基因型：野生型、杂合子以及纯合子，但纯合子在胚龄11d时死亡，所以出生的后代只有两种基因型，需要对子代野生型和杂合子进行基因型鉴定。

1.3.1 鼠尾DNA提取

小鼠断奶后，切取尾尖长度2～3mm，放入0.6mL EP管中。管中加入组织裂解液50～100μL，样品在恒温混匀器中250r/min，56℃，恒温震荡4h或过夜，使鼠尾得以彻底消化裂解。将裂解完全的样品置于PCR仪上，设置程序：①95℃，10min；②4℃保存。

上述制得的裂解样品可以直接作为PCR扩增的DNA模板溶液，20μL的反应体系，需要加本裂解样品0.2～1μL作为DNA模板。

1.3.2 PCR反应及琼脂糖凝胶电泳

(1)PCR反应：鉴定引物序列由维通达生物技术有限公司提供，由上海生工合成。引物序列：上游引物，5’-ACCCTGGCTCTTACCTTCCTTCC-3’；下游引物，5’-CTCGCAGATGTTTGAGGTGAGGTAG-3’。Endoglin+/-仅有600bp的条带，野生型仅有1 700bp的条带。

(2)PCR反应体系(20μL)：2×Taq PCR Mix，10μL；灭菌ddH2O，8.7μL；10μmol/L上游引物，1μL；10μmol/L下游引物，1μL；模板DNA，0.3μL。

使用PCR扩增仪进行Touchdown循环扩增，扩增参数设定：95℃预变性4min；95℃变性20s，64℃复性25s，72℃延伸30s，38个循环；最后72℃延伸2min；4℃保存备用。

(3)琼脂糖凝胶电泳:将PCR反应终产物7μL于2%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。然后依据琼脂糖凝胶基因型600bp和1 700bp片段大小分辨出各类基因型小鼠。

1.4 Endoglin基因在心肌中的表达

分别取野生型和敲除鼠的心脏组织，通过Western blotting检测endoglin蛋白的表达水平。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 小鼠基因型鉴定的结果

从图1可以看出3、9、10、11、12、13、16、17、18、21、22全部都呈现出一条1 700bp的条带，为野生型(wild type，WT)；1、2、4、5、6、8、14、15、19、20、23、24全部呈现出一条600bp的条带，为endoglin+/-；而7号没得到任何条带，需要进一步确定。

M代表marker；数字代表小鼠的编号图1 Endoglin基因敲除小鼠基因型的鉴定

2.2 Endoglin基因在心肌中的表达情况

随机选取两只endoglin+/-敲除鼠和两只同窝WT小鼠，取其心肌组织进行蛋白电泳，结果发现两只WT小鼠的CD105蛋白的表达量都明显高于两只endoglin+/-敲除鼠(P<0.05)，见图2～3。

图2 Endoglin基因在心肌中的表达

与WT组比较，*P<0.05，n=6图3 WB结果的灰度值分析

3 讨 论

基因敲除技术常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。利用基因敲除小鼠研究某一基因的生物学功能也已经引起许多研究者的关注，建立稳定的基因敲除小鼠模型对于课题组下一步的实验具有重要意义。在我们的实验中，利用PCR扩增技术以及琼脂糖凝胶电泳的方法对敲除endoglin基因的C57小鼠进行基因鉴别，在构建了基因敲除小鼠后，随机抽取心脏样本，利用WB技术验证小鼠心肌组织中CD105基因的蛋白表达水平。结果显示，两只WT小鼠的CD105蛋白的表达量都明显高于两只endoglin+/-敲除鼠(P<0.05)，说明endoglin+/-敲除鼠的CD105蛋白表达明显下降，证明在CD105基因半敲除后，在目标类型的表型上完全符合预期，成功构建了敲除endoglin+/-基因杂合子小鼠模型，为深入研究endoglin基因在心肌中的生物学功能奠定了基础。同时也提供了良好的动物模型，可用于后续糖尿病心肌病的研究。

Endoglin是一种细胞膜糖蛋白，主要表达在构成动脉、静脉和毛细血管的内皮细胞上，是TGF-β受体复合物的副成分。Endoglin参与血管的发育和重构，在心血管疾病、血管生成过程和癌症中发挥重要作用[3]，可以被基质金属蛋白酶裂解形成可溶性的endoglin(S-endoglin)，并释放到血液循环中，被认为是动脉粥样硬化、二型糖尿病和肝脏疾病等心脏代谢紊乱的危险因素。循环中S-endoglin的增加发生在不同的病理生理过程中，如内皮损伤、迁移、血管生成、炎症、心血管疾病、子痫前期和肿瘤血管生成[4-6]。

有研究表明[7]，endoglin在平衡TGF信号通路中发挥重要作用，从而调节内皮细胞的增殖和迁移。近年的研究表明[8-10]，S-endoglin和TGF-β信号通路在心肌纤维化的过程中似乎都有参与。有报道[2]研究了endoglin作为TGF-β1家族的协同受体，调节这些因子激活的细胞内信号通路，抑制TGF-β1信号通路，影响肿瘤发生和造血功能。

Endoglin参与血管生成，其在心血管风险中的作用已得到很好的证实，因为血浆可溶性endoglin水平的升高与冠状动脉血管收缩有关，而冠状动脉血管收缩可能导致心脏纤维化和围生期心肌病[11]。TGF-β载体介导的信号通过与内皮细胞中的TGF-β载体特异性膜受体复合物结合而启动，包含3种受体，其中一种共受体或TGF载体Ⅲ型受体，称为S-endoglin，这些受体通过磷酸化将信号传播到下游的核受体-Smads，导致Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠ，CollⅠ)异常增多和比例失调，进而促进心肌纤维化[12-13]。所以S-endoglin可能将成为一种新型治疗糖尿病心肌病的治疗靶点，防止右心室纤维化，改善右心室压力超负荷的功能，提高其生存率[14-15]。因此，endoglin基因敲除鼠将成为研究糖尿病心肌病的动物模型，为进一步研究提供了物质基础。