医用温敏/自显影聚(N-异丙基丙烯酰胺)-共聚-四碘磺酸水凝胶的制备及性能研究*

谢文静，周宏福，郭安然，王自瑶，王世越，郑 敏，李 玲

(湖北科技学院医学部药学院，湖北 咸宁 437100)

肝动脉化疗栓塞术(transcatheter hepatic arterial chemoembolization,TACE)是不可切除肝癌的首选姑息治疗方法，这种常见的介入手段是通过患者大腿根部的股动脉将细微的导管穿入，运用数字减影血管造影机的透视引导，将导管送至肝内肿瘤部位，并将抗癌药物、栓塞剂通过导管注入肝内肿瘤动脉的治疗方式[1]。

聚(N-异丙基丙烯酰胺)类聚合物水凝胶可以解决“流动-栓塞”的矛盾问题：在体外，它具有良好的流动性，容易通过细长导管注射弥散到微小的肿瘤末梢血管内，进入体内以后，其高强度的栓塞可抵抗血流冲刷，防止血管复通，引起肿瘤的缺血、缺氧、坏死[2]。目前，有关聚(N-异丙基丙烯酰胺)类聚合物水凝胶在药物递送与血管栓塞治疗领域的研究广泛，通过化学偶联、物理吸附等方式与药物组装，可以实现较好的载药目的[3]；此外，在聚(N-异丙基丙烯酰胺)类水凝胶上接枝亲水性的单体，可进一步提高其最低临界温度；其次，与金纳米颗粒复合物组装，还可以联合光热治疗与射频消融等技术，对肿瘤部位实现全方位的治疗，大大降低复发、转移的可能[4]。

然而，针对如何提高聚(N-异丙基丙烯酰胺)类聚合物水凝胶作为栓塞材料使用时的显影效果鲜有研究。目前，临床常用的血管栓塞材料有超液化碘油、明胶海绵、聚乙烯醇颗粒/微球、高分子微球等[5]，在使用过程中存在着以下不足：栓塞过程可控性差，无法实现对悬浮的栓塞材料进行实时监控，易造成异位栓塞；栓塞终点判定难，栓塞剂量难控制，易引起过度栓塞或者误栓[6]；栓塞后随访不利。本研究首次设计合成了一种新型聚(N-异丙基丙烯酰胺)-共聚-四碘磺酸(NIPAM-co-Fisa)水凝胶材料，其温敏特性来源于N-异丙基丙烯酰胺水凝胶上的亲水结构酰胺基以及疏水结构异丙基，而四碘-2-磺酸苯甲酸酐与甲基丙烯酸羟乙酯化合物的成功接枝，赋予了凝胶以自显影功能，相比物理混合显影剂，不易被血液冲刷快速清除，稳定性更好，栓塞剂量也能被很好地把握，术后还可采取影像学手段对栓塞材料在病灶内的分布情况进行长期监测和随访。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与动物

N-异丙基丙烯酰胺(分析纯,98%)购自百灵威化学试剂网；N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(分析纯，>99%)，十八烷基三甲基氯化铵(分析纯，98%)，2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(分析纯，97%)，四碘-2-磺酸苯甲酸酐(分析纯，>95.0%)，均购自阿拉丁试剂网；无水碳酸钠(分析纯，≥99.9%)，甲基丙烯酸羟乙酯(96%,含250ppm MEHQ稳定剂)，水合氯醛(分析纯，>99.0%)均购自上海麦克林试剂网；碘海醇购自江苏恒瑞医药；C57BL/6J小鼠，成年新西兰大白兔，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

1.2 实验仪器

BSA124S分析天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)；DF-Ⅱ集热式恒温磁力搅拌器(江苏金坛亿通电子有限公司)；FT-IR红外光谱仪(美国铂金埃尔默)；凝胶渗透色谱仪(岛津)；电感耦合等离子体质谱仪(PerkinElmer Nexion 300X)；ZEN3700激光粒度仪(英国马尔文公司)；TU-1901紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；TESCAN VEGA3扫描电镜(TESCAN泰思肯贸易上海有限公司)；TecnaiG2 20透射电子显微镜(荷兰FEI公司)；高级旋转流变仪(英国马尔文公司)；THZ-C-1台式冷冻恒温振荡器(常州金坛中旺仪器制造有限公司)；真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)；切片数字扫描仪(武汉赛维尔生物科技有限公司)；数字减影血管造影机(德国西门子)。

1.3 四碘-2-磺酸苯甲酸酐与甲基丙烯酸羟乙酯的化合物制备

精确称取0.25g(0.36mmoL)的四碘-2-磺酸苯甲酸酐，置于100mL的无水干燥两颈烧瓶中，以20g的四氢呋喃做溶剂，在室温状态下以500rpm/min的转速搅拌混匀，再称取0.05g(0.38mmoL)的甲基丙烯酸羟乙酯，以10g的四氢呋喃做溶剂，采用恒压漏斗缓慢滴加在预先混匀的反应液中，继续反应4h后，停止反应，收集所得溶液，采用旋转蒸发仪以55℃的水浴加热，200rpm/min的转速旋转蒸发，除去溶剂四氢呋喃，将剩余的固体产物溶解于适量纯水中，称取无水碳酸钠0.04g(0.32mmoL)，将pH调节至中性，对固体产物水溶液进行多次反复洗涤，再次旋蒸，最后使用冷冻干燥机冻干后得到荧光绿色固体粉末，放入锥形瓶中密封保存备用(图1)，并利用公式计算产物的实际收率为72%。

图1 四碘-2-磺酸苯甲酸酐与甲基丙烯酸羟乙酯化合物反应原理图

1.4 NIPAM-co-Fisa纳米水凝胶的制备

精确称取N-异丙基丙烯酰胺1.7g(15mmoL)，N，N′-亚甲基双丙烯酰胺0.03g(0.19mmoL)，2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐0.08g(0.29mmoL)，十八烷基三甲基氯化铵0.05g(0.14mmoL)，超纯水140mL，溶解至250mL的三颈烧瓶中，外接冷凝回流装置和温度计进行实时监控，然后置于油浴锅中500rpm/min搅拌混匀至所有试剂均溶解后，升温70℃，恒温搅拌反应直到溶液充分引发，观察溶液变蓝以后，称取0.2g(0.24mmoL)四碘-2-磺酸苯甲酸酐与甲基丙烯酸羟乙酯化合物，充分溶解于10mL纯水后，采用恒压漏斗持续滴加至聚合物反应液中，继续搅拌反应，可观察到溶液逐渐由淡蓝色转变为乳白微黄色，继续反应约4h后终止反应。将反应后的溶液冷却至室温，冷却过程仍保持磁力搅拌，最后装入透析袋(截留分子量为14000Da)中透析，透析介质为超纯水，透析4～5d后取出，冷冻后采用真空冷冻干燥机中冻干得到NIPAM-co-Fisa纳米凝胶粉末，放入锥形瓶中密封保存(图2)。

图2 NIPAM-co-Fisa纳米水凝胶聚合原理图

1.5 NIPAM-co-Fisa纳米水凝胶的表征方法

利用溴化钾(KBr)压片法，采用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)测试纳米凝胶红外吸收官能团，电感耦合等离子体质谱仪对凝胶中的碘元素含量进行测定。采用凝胶渗透色谱(岛津，微型苯乙烯HR-6和HR-4柱)，以THF为流动相，1.0mL/min的流速测定分子量。采用加速电压100→220KV的透射电镜和扫描电镜分别对磷钨酸染色的凝胶样品以及喷金处理后的纳米凝胶形貌进行表征。利用动态光散射粒度仪对纳米凝胶的粒径和分散性进行表征。采用紫外可见分光光度计在500nm处对纳米凝胶的透过率进行表征。采用高速旋转流变仪PP50平板，直径50mm，设置间隙0.5mm，压力0.05Pa，升温范围25℃～50℃，升温速率1.0℃/min，频率1.0Hz，对纳米凝胶的流变性能进行表征。

1.6 NIPAM-co-Fisa的生物相容性试验

选取健康成年C57BL/6J小鼠9只，适应性喂养一周后，随机分成生理盐水注射组、凝胶注射一周组和凝胶注射一月组，每组3只，将实验小鼠用0.2mL的10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，采用小动物剃毛刀将小鼠背部约0.3cm×0.2cm的毛发剃去，充分暴露皮肤，分别抽取0.5mL的生理盐水或NIPAM-co-Fisa水凝胶分散液，注射至小鼠背部皮肤内，注射完毕后，可见皮下局部微微隆起，分别于一周、一月后处死小鼠，切开皮肤观察水凝胶的状态，并观察注射部位皮肤有无炎症、脓肿、溃烂，收集注射部位的皮肤组织，采用4%多聚甲醛固定，做病理切片HE染色分析，评估NIPAM-co-Fisa的生物相容性。

1.7 NIPAM-co-Fisa体内肾动脉栓塞效果评价

为探究NIPAM-co-Fisa体内栓塞兔肾动脉的可行性、安全性和持久性，采用3只健康新西兰大白兔作为正常肾动脉栓塞模型[8]，实验兔雌雄不限，体重2.5～3.0kg，将实验兔禁食、禁饮12h，称重后，以10%水合氯醛2.5mL/mg进行腹腔注射，待家兔麻醉后，仰卧位固定于木板上，行右侧腹股沟备皮，常规无菌消毒后，用穿刺针穿刺股动脉，引入短导丝，退出穿刺针外管套，引入4F血管鞘并用缝线固定，完成股动脉插管。将预先准备好的肝素化盐水与碘海醇造影剂混合液注射至肾动脉，观察到“冒烟”现象后，再注入适量肝素化盐水冲洗导管，抽取经消毒灭菌后的NIPAM-co-Fisa凝胶水分散液1mL，连接高压注射器开始行肾动脉造影，利用数字减影血管造影机向兔左肾动脉缓慢注入NIPAM-co-Fisa凝胶水分散液，见肾动脉主干完全栓塞后，再行DSA复查造影。

2 结 果

2.1 NIPAM-co-Fisa水凝胶的分子量、碘含量、结构和形貌表征

电感耦合等离子体质谱仪，测试结果显示碘元素接枝浓度占凝胶体系的2%(表1)，计算公式：

表1 ICP-MS结果

(1)

(2)

GCP凝胶渗透色谱分析结果显示，NIPAM-co-Fisa纳米凝胶的重均分子量为7118g/moL、数均分子量为3082g/moL，Z均分子量为14322g/moL(表2，图3a)；通过FT-IR红外光谱仪分析可知(图3b)，3435cm-1为N-H的伸缩振动峰；3073cm-1为C-H的伸缩振动峰；2972cm-1、2932cm-1、2876cm-1为CH3的伸缩振动峰；1650cm-1为强酰胺Ⅰ带的C=O基伸缩振动峰；1545cm-1为强酰胺Ⅱ带的N-H弯曲振动峰；1459cm-1为苯环骨架C=C的动；1367cm-1、1387cm-1的双吸收峰为异丙基的特征吸收峰[9]；1210cm-1、1063cm-1、633cm-1、529cm-1则为磺酸基的特征吸收峰[10]；974cm-1、927cm-1、882cm-1、838cm-1则为苯环的指纹取代区吸收峰[11]。综上分析，红外结果显示其具备N-异丙基丙烯酰胺的基本结构，且含有磺酸基和苯环的特征基团，表明NIPAM-co-Fisa水凝胶已被合成上；纳米激光粒度仪结果显示(图3c)，当温度在25℃时，NIPAM-co-Fisa水凝胶的平均粒径为630.9nm，分散性为0.626，而当温度接近人体温度位于37℃时，NIPAM-co-Fisa水凝胶的平均粒径为268nm，分散性为0.529。相比25℃时的凝胶尺寸和分散性而言，37℃时的凝胶平均粒径缩小近一半，表现出较强的温度敏感性，主要的原因在于温度升高，纳米凝胶溶液的疏水性增强，出现了消溶胀，即收缩状态，因此，纳米凝胶粒径就随之减小。此外，通过扫描电镜(图3d)和透射电镜图片(图3e)可以发现，NIPAM-co-Fisa水凝胶为大小较为均一的核壳球形结构。

表2 GPC结果

a.GPC色谱图；b.红外光谱分析；c.不同温度下的粒径变化；d.SEM照片；e.TEM照片

2.2 NIPAM-co-Fisa水凝胶的温敏特性表征

将装有NIPAM-co-Fisa水凝胶分散液的透明玻璃瓶，置于30℃～40℃，每个温度下稳定放置10min，再观察其在对应温度下的相应变化(图4a)。在30℃～34℃时，凝胶为可流动的溶胶状态；当温度位于35℃～40℃时，凝胶水分散液则变为不可流动的凝胶相，倾斜放置后，仍然固定在瓶底，不再流动；此外，通过紫外分光光度计，在500nm处评估NIPAM-co-Fisa水凝胶透过率为50%的温度，判断NIPAM-co-Fisa的浊点温度为34℃左右(图4b)，同时，对25℃～50℃温度下的NIAPM-co-Fisa的弹性模量(G′)和粘性模量(G″)进行分析(图4c)，当G″>G′，即25℃～34.1℃时，粘性占主要部分，水凝胶表现为流体；而当G″=G′，即34.1℃时，粘性和弹性模量相等，为溶胶-凝胶转变点；G″

a.瓶倒转法试验分析；b.紫外光谱分析；c.高速旋转流变仪分析

2.3 NIPAM-co-Fisa水凝胶的生物相容性评价

待实验小鼠麻醉后，剃去背部毛发，皮下注射0.5mL的生理盐水或水凝胶，有微微隆起(图5a)。小鼠苏醒后继续喂养一周或一月，将注射凝胶的小鼠处死切开皮肤，可见一块状凝固的凝胶与组织粘连(图5b)，表明NIPAM-co-fisa水凝胶在注射进小鼠皮下以后，受到体内温度响应，发生溶-凝胶相转变现象凝固成团，且具有良好的稳定性，不易降解，在喂养一月以后，切开小鼠皮肤，仍表现为弹性较好的块状凝胶。此外，使用4%的多聚甲醛对注射部位处的组织进行固定，制作病理切片，通过HE染色进行病理学分析，可以看到，注射生理盐水组的小鼠正常组织边界清晰，细胞核较小(图5c)；注射水凝胶一周后的小鼠组织切片显示，组织边界不清、间隙增大、大量炎性细胞浸润(图5d)；推测此时为水凝胶注射引起的急性炎症期；而注射水凝胶一月后的小鼠存活状态良好，组织切片则显示经过4周的时间，其炎症反应逐渐消退，炎性细胞数量减少，与正常组织形态相近(图5e)。

a.注射水凝胶的第0d；b.注射水凝胶1月后，处死切开皮肤后的水凝胶状态；c.正常组织HE染色；d.凝胶注射1周后病理切片HE染色；e.1月后病理切片HE染色

2.4 NIPAM-co-Fisa水凝胶的体内肾动脉栓塞效果评价

正常兔肾栓塞术前，先注入适量的肝素化盐水和碘海醇造影剂混合液，通过数字减影血管造影结果可观察到肾动脉血管走向清晰且通畅，左肾动脉造影可见“肾树”形成(图6a)，然后再向兔左肾动脉缓慢注入NIPAM-co-Fisa水凝胶分散液1mL，注射的NIPAM-co-Fisa凝胶水分散体流动性良好，数字减影血管造影显示NIPAM-co-Fisa能较好分散至肾动脉末梢区，且凝胶自身的温敏特性致使其能较快出现溶-凝胶相转变，随温度上升后逐渐铸型并原位凝固(图6b)，栓塞过程由肾皮质区经肾门区，再到肾动脉主干，未出现返流现象。

图6 数字减影血管造影下的兔肾动脉栓塞

3 讨 论

本研究以临床栓塞材料面临的缺陷问题作为切入点，巧妙地将聚(N-异丙基丙烯酰胺)类水凝胶与含碘化合物接枝，制备获得了既具有良好温敏效应又具有自显影效果的NIPAM-co-Fisa水凝胶。通过研究证明，NIPAM-co-Fisa水凝胶的温敏性良好，溶-凝胶相转变温度为34℃，与人体的生理温度接近，能在体温环境下转变为凝固状态；采用C57BL/6J小鼠水凝胶注射模型模拟体内环境，可发现NIPAM-co-Fisa水凝胶具有较好的稳定性，不易降解，且生物相容性好，安全性高；采用正常兔肾动脉栓塞模型，也进一步证实NIPAM-co-Fisa水凝胶在体内栓塞运用的可行性，有望作为一种新型医用栓塞材料运用于动脉栓塞治疗之中。同时，其具备的自显影效果，在实现栓塞的同时，也为影像学的长期随访提供便捷，此外，它还可有效解决部分造影剂易被血液冲刷、半衰期短等问题。后续的研究工作也将陆续深入开展，以进一步提高含碘化合物在N-异丙基丙烯酰胺链上的接枝浓度，从而增强自显影的效果，同时，协同负载化疗药物，采用兔VX2肝肿瘤模型，来全面评估制备的NIPAM-co-Fisa水凝胶对肿瘤血管是否也同样具有较好的栓塞效果，并对肿瘤的缺氧坏死情况进行系统分析，利用CT进行随访观察，以了解NIPAM-co-Fisa水凝胶在动脉栓塞治疗过程中的稳定性和长期显影效果。