法西多曲对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究

陈 辉，郑 敏

(1.咸宁市中心医院/湖北科技学院附属第一医院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院)

近年来，急性心肌梗死的发病率与死亡率明显上升，严重威胁人类的生命健康，迅速恢复血供，即再灌注治疗是挽救急性心肌梗死的根本措施。大量研究表明[1-2]，再灌注不一定会使缺血损伤的组织细胞得到恢复，在一定条件下反而造成或加重心肌细胞的损伤,即心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。心血管内科疾病中常遇见心肌缺血再灌注损伤的问题，肾素血管紧张素系统(RAS)参与心血管循环的生理病理过程，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)激活RAS，导致血容量增多和钠水潴留，血管收缩[3-4]。抑制肾素-血管紧张素系统能有效预防心肌梗死造成的心肌缺血再灌注损伤[5]。目前临床尚无特效的治疗心肌缺血再灌注损伤的手段，因此，越来越多的专家学者开始致力于心肌缺血再灌注损伤治疗方法的研究。法西多曲(Fasidotril)是血管紧张素转化酶和肽链内切酶(NEP)双重抑制剂，通过对血管紧张素转化酶的抑制作用及减缓中性肽酶抑制剂对尿钠肽的降解作用，从而起到扩血管、排纳利尿、抑制细胞增生、抑制交感神经等作用。法西多曲作为一种新型抗高血压及心力衰竭的药物，在心血管疾病治疗方面具有潜在的价值。本研究旨在探讨法西多曲对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SPF级雄性SD大鼠(40只)，体重(280±20)g，由湖北省实验动物研究中心[许可证号SYXK(鄂)2015-0018]提供。AngⅡ试剂盒、ACE抗体及AT1抗体均购自北京奥森鼎信生物技术有限公司(货号分别为：A9847、sc-23908、sc-1173)，DAB显色剂购自武汉谷歌生物科技有限公司(货号：G1210)；生物信号采集与分析系统(型号：BL-420F)；法西多曲购自重庆莱美药业股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 大鼠模型制作与分组

将40只SD大鼠适应性喂养至(300±20)g，随机分为4组，分别为正常组(NC)、模型组(IR)、法西多曲低剂量(2.5mg/kg)组(FAS-L)和法西多曲高剂量(25mg/kg)组(FAS-H)，每组10只。采用10 % 水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，BL-420F生物信号采集与分析系统观察并记录大鼠心电图。30min后再剪线灌注2h，以心电图ST下降一半(见图1～2)即可判断大鼠心肌缺血再灌注损伤模型成功建立。NC组仅穿线不结扎，FAS组在结扎前15 min舌下静脉注射法西多曲。

图1 心肌缺血前心电图

图2 心肌缺血后心电图

1.2.2 左心室血流动力学监测

大鼠心肌再灌注2h后，将换能器连接上BL-420F生物信号采集与分析系统，PE50导管插进大鼠的右颈总动脉，导管进入左心室时电脑显示器会出现较多的压力差，等待波形图稳定15min后，记录各组LVSP、LVEDP和HR的值。

1.2.3 酶联免疫吸附法

颈总动脉取血离心收集上清液，缺血部位的心肌组织放入适量的PBS缓冲液中(pH7.4)，手动匀浆，离心10min(3000转/min)，收集上清液，接着按照ELISA试剂盒的操作步骤对AngⅡ进行含量检测。

1.2.4 免疫组化法

取3μm石蜡组织切片脱蜡水化，用3% H2O2溶液室温阻断10min，滴加兔抗大鼠多克隆抗体溶液，4℃孵育过夜；滴加聚合物增强剂50μL，室温静置20min；加酶标羊抗兔聚合物50μL，室温孵育30min，PBS冲洗。用0.02% DAB显色10min；PBS冲洗，5min×3次；苏木素复染5min，自来水洗1min，梯度酒精分化并脱水。二甲苯透明，中性树胶封固。每组选取5例，每例在400倍光学显微镜下随机选取5个视野拍照，采用图像分析系统进行定量分析。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 法西多曲对IR大鼠血流动力学指标的影响

BL-420F生物信号采集与分析系统对各组大鼠心功能分析结果显示，与NC组相比，IR组HR减慢(P<0.01)，FAS组HR显著提高(P<0.05)；IR组LVSP、+dp/dpmax显著降低；FAS组LVSP和+dp/dpmax较IR组显著提高(P<0.01)。与NC组比，IR组LVEDP明显增加(P<0.01)，-dp/dtmax显著降低(P<0.01)，FAS组LVEDP低于IR组，但高于NC组，LVEDP降低效应随剂量增加有增强趋势(P<0.01)，结果见表1。

表1 法西多曲对大鼠血流动力学指标的影响

2.2 法西多曲对大鼠血液和心肌组织中AngⅡ的影响

采用完全随机设计的方差分析对大鼠血液和心肌组织中AngⅡ浓度进行分析，总体数据组间比较有统计学意义(P均<0.05)。法西多曲能减少心肌缺血再灌注损伤大鼠血液和心肌组织中AngⅡ的表达(P均<0.05)，结果见表2。

表2 不同组别大鼠血液中AngⅡ浓度的比较

2.3 心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌中AT1、ACE表达情况

在各组免疫组化染色细胞实验中AT1、ACE在心肌细胞中都有表达，阳性细胞胞浆呈棕褐色或棕黄色者。与NC组相比，IR组中AT1免疫阳性表达显著增加；心肌组织中出现大量ACE免疫强阳性表达细胞,表明心肌缺血再灌注引起RAS明显激活;与IR组相比，FAS组心肌AT1免疫阳性表达明显减弱与假手术组无明显差异,ACE免疫阳性细胞数及阳性表达强度明显减弱但仍有轻度表达,随药物剂量增大心肌AT1、ACE的免疫阳性表达均进一步减弱。详见图3～4。

图3 各组大鼠心肌组织中AT1表达变化(×400)

图4 各组大鼠心肌组织中ACE表达变化(×400)

3 讨 论

急性心肌梗死作为常见的心血管疾病，起病急、病情进展速度快,患者表现为胸骨后持续疼痛、心力衰竭以及心律失常等，具有较高的死亡率和致残率，预后差。中老年人群为急性心肌梗死的高发群体，急性心肌梗死已经成为威胁中老年人群生命安全的主要疾病。心肌再灌注损伤包括心肌功能损害和心肌组织代谢混乱，还包括心肌构造的损坏。心肌重构的重要介导因素是RAS的激活，AngⅡ作为效应因子，其增高可导致心血管功能紊乱、心肌肥厚、坏死、凋亡和诱导心肌重构[6]，肾素-血管紧张素的激活加剧了心肌细胞的缺血再灌注损伤。持续RAAS的激活心肌可增加缺血梗死范围，又进一步激活RASS，使病情循环加重，并且AngⅡ影响血流动力学[7]。本文通过将法西多曲低、高剂量组和心肌缺血再灌注损伤模型组进行对比，发现法西多曲能明显减少心肌缺血再灌注损伤大鼠血液中AngⅡ的表达。

左心室舒张功能损伤比心肌缺血再灌注损伤发生早，甚至发生更严重的病理变化[8-9]，血流动力学是评价心脏收缩性功能的重要指标[10]。LVSP是左心室收缩期压力的最大值，LVEDP是左心室舒张末期的压力，+dp/dtmax是心肌变力性干预十分敏感的指标，-dp/dtmax增加表示左室舒张功能的改善[11]，若动脉压降低或不变，-dp/dtmax降低则表示心室舒张功能异常。当左心室功能下降时，LVSP降低，LVEDP上升[12-13]。张苗苗等[14]通过大鼠缺血后适应处理减少心肌缺血再灌注损伤，发现大鼠缺血再灌注模型组LVSP，+dp/dtmax和-dp/dtmax均较假手术组低，而LVEDP较假手术组高。与本实验结果相似。与NC组相比，IR组LVSP，+dp/dpmax显著降低；FAS组LVSP和+dp/dpmax较IR组显著提高(P<0.01)。与NC组比，IR组LVEDP明显增加(P<0.01)，-dp/dtmax显著降低(P<0.01)，FAS组LVEDP低于IR组，但高于NC组，LVEDP降低效应随剂量增加有增强趋势(P<0.01)，可以看出心肌缺血再灌注能够影响血流动力学。

心肌缺血再灌注时，循环及心肌局部AngⅡ、ACE和AT1水平显著增加，AT1为 AngⅡ的受体之一，而ACE可催化产生AngⅡ[15-16]。AT1在IR期间表达上调，影响肾素血管紧张素系统，有助于抑制心肌间质重塑，影响心功能[17-18]。有实验证明西地那非能够减轻心肌缺血再灌注导致的心脏功能降低，提高心肌缺血再灌注模型的存活率，抑制AT1的上调，减少AngⅡ的表达[19]。依那普利在心脏骤停和复苏时通过调控血液和心肌中的ACE/AngⅡ/AT1R的表达而改善缺血再灌注损伤[20]。在本实验表明法西多曲可减少血液中和心肌组织中AngⅡ表达，其中FAS-H组中AngⅡ影响较FAS-L组明显。免疫组化染色结果显示，阳性表达的棕褐色细胞在IR组表达显著增加，药物治疗组细胞表达降低。与FAS-L组比较，FAS-H组AT1、ACE阳性表达明显减少。心肌缺血再灌注时AngⅡ的表达增加，而在FAS组中AngⅡ明显下降，说明法西多曲对RAS也有抑制作用。

法西多曲是血管紧张素转化酶和中性内肽酶(NEP)的抑制剂，通过RAS系统在心血管系统中起重要作用，可扩张血管，抑制NEP，改善内皮功能等[21]。法西多曲可用于长期治疗大鼠心肌梗死[22]。本研究表明法西多曲对心肌缺血再灌注损伤有一定的保护作用，为新一代防治肌缺血再灌注损伤的药物开发提供了方向。