栀子对正常大鼠肾脏毒性代谢产物的影响*

丽 丽，乌日汉，毕力格，孟香花，宝乐尔，陈玉花，韩晓静，白梅荣

(内蒙古民族大学蒙医药学院/蒙医药研发工程教育部重点实验室，内蒙古 通辽 028000)

栀子作为蒙药的《三子》药材之一，在蒙医药的应用广泛。研究资料显示，本品为茜草科植物栀子(Gardenia)的成熟干燥果实，具有苦、凉、钝、糙等药性，主治血热、肝热、面目发黄、血希日性眼病、肾热、膀胱热、口渴[1]。现代研究资料表明[2-3]，栀子具有抗炎、抗氧化、治疗糖尿病、降压、调脂、保肝、神经保护、保健、保护视力、降血糖、抗动脉粥样硬化、抗菌、抗肿瘤、保肝利胆、抗抑郁等现代药理作用。课题组前期研究[4]中发现栀子苷在肾脏有明显的分布，推测栀子对肾脏疾病及代谢产物具有一定的影响。因此，本研究以栀子为研究药物，以正常大鼠为研究对象，采用代谢组学分析方法，探讨栀子临床等效量(3.8571g/kg)连续21d给药后对肾组织代谢产物的影响，以期为栀子对肾脏功能调节研究提供科学铺垫。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物

SD雄性大鼠，SPF级，体质量为(200±20)g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供[SCXK(辽)2015-0001]。

1.1.2 药品与试剂

实验药品与试剂信息，见表1。

表1 实验药品与试剂信息

1.1.3 仪器

实验仪器信息，见表2。

表2 实验仪器信息

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及取材

取大鼠16只，按体重随机分为正常组8只(K8组)和给药组6只(K6组)。从实验第一天开始，给药组灌胃栀子生药粉碎的5%CMCNa溶液(3.8571g/kg)，1次/d，连续21d。正常组灌胃等容量5%CMCNa溶液。末次给药30min后麻醉，采集同一部位肾组织置-80℃冻存管储存，备检。

1.2.2 代谢物提取

称取50mg肾脏样品放置于PE管，再加入1 000μL甲醇，采用研磨器制备50%匀浆液，离心15min(4℃，12 000rpm)，分离匀浆液，取上清液进样10μL，用液质联用仪(UPLC-MS)检测。

1.2.3 UPLC-MS检测

(1)色谱柱：Waters BEH HILIC 色谱柱(100×2.1mm，1.7μm)。流动相：A(0.1%甲酸水，乙酸铵)和B(乙腈)；柱温：35℃；流速：0.3mL/min；进样量：10μL。洗脱梯度如表3。

表3 梯度洗脱程序表

(2)质谱参数条件：采用电喷雾电离(ESI)正离子和负离子模式进行检测。ESI源条件如表4。二级质谱采用 information dependent acquisition(IDA)获得，high sensitivity模式，去簇电压(DP)为±60V，碰撞能量为(35±15)eV。

表4 ESI源条件

1.3 统计学方法

应用SPSS 22.0进行统计分析。采用t检验、秩和χ2检验、单因素方差分析分别进行组间比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 PCA 分析结果

PCA通过新变量对各组数据进行归类，去除重复性差和异常样本，可观察样品的聚集、离散程度。如图1所示，K8组与K6组大鼠肾组织代谢物出现一部分分离，一部分重叠的现象，说明代谢物具有一定的差异。利用MetaboAnalyst软件进行聚类分析，以热图的聚类结果分析组间差异，颜色深浅表示代谢物水平，红色为升高、蓝色为降低。如图2所示，K8组与K6组的代谢物相对丰度呈明显差异，表明栀子可使大鼠肾组织代谢物产生一定变化。

图1 肾代谢物 PCA

图2 肾代谢物热图

2.2 OPLS-DA结果

OPLS-DA作为一种有监督的分析方法，能够筛选出差异代谢物。如图3所示，K8组大鼠肾组织代谢物与K6组完全分离，说明代谢物谱有显著差异。通过参数检验进行OPLS-DA模型验证，具有良好的准确率和预测率(参数R2Y和Q2均大于0.5)。

图3 肾OPLS-DA的S-plot图

2.3 肾脏差异代谢物的筛选

为寻找潜在差异代谢物，采用OPLS-DA中VIP≥1和P<0.05，且fold change>1.5(或<0.5)的标准筛选，通过MassBank、Respect、GNPS数据库进行检索分析。甜菜碱、烟酰胺明显上升，氨基戊酸、天冬氨酸盐明显下降，见表5。

表5 肾脏差异代谢物鉴定

2.4 差异代谢物通路分析

采用MBRole 2.0分析软件，对差异代谢物进行通路富集分析。如图4所示，肾组织差异代谢物涉及通路分别为：嘧啶和嘌呤代谢、蛋白质消化和吸收、氨基酸的生物合成和代谢、氨酰-tRNA的生物合成、ABC转运蛋白等代谢通路。

图4 肾脏样品代谢通路气泡图

3 讨 论

栀子是蒙医临床常用于治疗血热引起的各种疾病的药物,临床传统用法主要集中于肝胆热，但未涉及肾热[2]。栀子主要成分栀子苷大量分布于肾组织,推测栀子可能对肾脏功能及代谢产物有一定调节作用[5]。本实验结果显示，肾组织中甜菜碱含量明显升高，原因可能是栀子对肾细胞有一定的毒性影响。通过实验发现肾组织烟酰胺含量升高，这可能表明栀子对肾组织新陈代谢有一定的毒性影响。与黄敏研究[6]一致。

氨基酸是机体所必需的生物活性物质，肾脏在氨基酸的合成、转运、排泄及重吸收等各个环节均发挥着重要作用，肾脏功能异常则氨基酸代谢异常。因此，氨基酸代谢异常可作为某些肾脏疾病的特征性改变,对肾病疾病的早期诊断具有重要意义。实验研究结果表明，栀子可使肾组织中天冬氨酸盐和氨基戊酸表达明显下降。可见，栀子对肾细胞也可能有一定损伤。该实验结果为栀子肾毒性的探索研究提供了线索。