温和灸对佐剂性炎症小鼠抗炎镇痛作用研究

付敏婕，张 立，冯 妮

(1.咸宁市中心医院/湖北科技学院附属第一医院康复医学科，湖北 咸宁 437100；2.咸宁市中心医院/湖北科技学院附属第一医院耳鼻咽喉科)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是一种常见的慢性退行性变，病变主要累及关节滑膜、关节软骨及软骨下骨重构，导致患者疼痛和关节活动受限，严重影响生活质量[1]。流行病学调查显示，65岁以上人群中近半数被膝骨关节炎困扰[2]。目前认为衰老、创伤、肥胖、炎症和基因水平的易感性等综合因素下，关节软骨的分解和合成代谢失衡，从而影响关节腔内微环境，导致疾病的发生和发展[3]。非甾体类抗炎镇痛药(non-steroid anti-inflammatory drugs，NSAIDs)是治疗膝骨关节炎的常用药物，但长期应用胃肠道副反应大。针灸是治疗膝骨关节炎的外治法之一，安全性和有效性高，但作用机制尚不完全清楚。本研究采用完全弗氏佐剂(freund’s adjuvant complete，CFA)制作膝骨关节炎和炎症小鼠模型，应用温和灸法治疗，为进一步研究艾灸抗炎镇痛机制做好前期准备。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

30只雄性C57BL/6J小鼠，体质量22～24g，购自成都中医药大学实验动物中心[清洁级，合格证号scxk(川)2012-16]。置于12L∶12D(光期7：01～19：00，暗期19：01～次日7：00)光暗对置条件下，室温(23±1)℃，饲养1周。基础足容积筛选合格的小鼠24只，随机分为对照组、模型组和模灸组，每组8只。

1.2 主要仪器与试剂

主要仪器：WZ-2300R无纸温度记录仪，LEICA DM4000B智能生物显微镜，5417R高速冷冻离心机，Nano drop 2000微量紫外分光光度计，FLUKO F6/10超细匀浆机，HH-S4数显双列四孔水浴锅，ImmunoWash 1575洗板机，iMark Microplate Reader酶标仪。主要试剂：小鼠艾灸条(5mm×120mm)由南阳汉医艾绒有限责任公司提供；PBS缓冲液、1%戊巴比妥钠、75%消毒酒精、0.9%氯化钠注射液、4%多聚甲醛、10%EDTA-Na2均由成都仁杰医疗器械有限公司提供；兔抗小鼠TNF-α多克隆抗体(克隆号：BA0312)、免疫组化(SP法)试剂盒均由武汉博士德生物工程有限公司提供；CFA由武汉中科万通仪器有限公司提供。

1.3 佐剂性炎症模型的制备

在小鼠右侧足底肉垫注射20μL CFA，对照组用相同的方法注射20μL生理盐水。注射CFA后第4d测量足容积，自身对照小鼠足容积超过50%则表示造模成功[4]，剔除造模未成功小鼠。

1.4 艾灸治疗和足容积测量方法

1.4.1 艾灸干预方法

造模成功后，模灸组小鼠艾灸右侧“足三里”(艾灸治疗前备皮)，根据卫生部“十二五”规划教材《实验针灸学》取穴。室温(23±1)℃，穴位皮肤温度维持在(42±1)℃，20min/次，1次/d，每周治疗6d，共治疗4周。模型组和对照组相同条件捆绑固定。

1.4.2 测量痛阈和足容积

采用足容积测量器测量小鼠足容积，实验全程由专人负责，减小偏倚，分别于造模前(基线)、造模后第4d测量1次，此后每5d测量1次，共测量6次。小鼠热痛阈采用热痛阈测量仪，分别于造模前(基线)、造模后第3d开始，连续测量19d。

1.5 取材及检测方法

1.5.1 取小鼠膝关节滑膜

末次治疗结束后2h取材，2%异氟醚麻醉断颈处死小鼠，全程取材在-4℃冰盘上进行。75%乙醇消毒小鼠右侧“足三里”处皮肤，以穴位中心为原点，用眼科剪剪下直径约1cm的圆形皮肤，放入冻存管，-80℃冰箱保存待测。剥离小鼠右后腿皮肤和肌肉，于膝关节上下1cm处截取膝关节，置于解剖显微镜下取出膝关节滑膜，4%多聚甲醛固定，4℃冰箱保存待测。

1.5.2 免疫组化检测

将标本置于10%EDTA-Na2脱钙10d(4℃冰箱)，梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片。免疫组化SP染色法参照试剂盒步骤进行。细胞膜或细胞质出现棕黄色颗粒为TNF-α。显微镜采集200倍视野下滑膜组织切片，采用Image pro plus 6.0软件进行量化分析。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组小鼠足容积比较

如图1示，造模后第4d，与对照组比较，模型组与模灸组足容积显著增加，差异有显著统计学意义(P<0.01)。第4～14d，模型组和模灸组小鼠足容积仍显著大于对照组，且两组间比较差异无统计学意义。从第14～24d，模型组和模灸组小鼠足容积均开始减小，但组间无统计学差异，且两组小鼠足容积仍大于对照组；第24d测量足容积，显示模灸组小鼠足容积较模型组小，且差异有统计学意义(P<0.05)；末次治疗后模灸组与对照组差异无统计意义(P>0.05)，模灸组小鼠已痊愈。

(与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01)

2.2 小鼠痛阈比较

如图2所示，造模后第3d，模型组和模灸组较对照组小鼠痛阈显著降低(P<0.05)，模灸组和模型组小鼠痛阈无差异。艾灸治疗第8d后模灸组小鼠痛阈较模型组降低(P<0.05)，自第14d开始两组小鼠痛阈有显著性差异(P<0.01)，第19d时，模灸组与对照组小鼠痛阈无差异。

(与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与对照组比较，#P<0.05，##P<0.01)

2.3 TNF-α免疫组化比较

如图3所示：治疗结束后，与模型组小鼠比较，模灸组小鼠关节滑膜TNF-α水平明显降低(P<0.05)。

A和B两图中褐色为阳性染色区，蓝色为细胞核，×200；C图为小鼠滑膜组织阳性染色区域百分比对比，*P<0.05

3 讨 论

温热效应是艾灸产生生物学作用的主要途径，局部温热刺激可激活皮肤感受器，通过释放生物活性物质、激活信号通路产生作用。而不同的温度激活的响应分子和信号通路可能不尽相同，故不同灸法的艾灸温度和灸量是我们探讨的内容。研究表明，艾灸的温热效应，即灸温的不同是产生生物学效应的关键因素[5-6]。有研究认为[7]，艾条燃烧时产生热、光、烟三要素，其中热效应是其主要的作用形式，艾灸的疗效主要取决于灸温。适宜的温热刺激可改变机体组织代谢、CO释放以及增加局部血流，有利于带走炎性物质，此外，灸温产生的生物学效应可直接起到抑制炎症因子释放的作用[8-9]。还有学者发现，灸温的高低和温度的渗透深度呈反比，温和灸的渗透性最好，灸温越高反而渗透性越低。有学者研究不同灸温下，艾灸对炎症痛小鼠模型镇痛作用的效应特点[10]，发现42℃灸的镇痛效果持续时间最强。本研究采用42℃灸，并发现艾灸的抗炎作用并非从治疗灸开始起效，而是在治疗了5次以后才出现显著疗效，这与艾灸的临床应用实践相符。中医学有“谨守病机，守方不移”的治疗原则，针灸疗效的产生也需要坚持按照疗程治疗。此外，有学者发现45℃灸对CFA大鼠模型中的镇痛和抗炎作用优于38℃灸，45℃灸组大鼠血清IL-1β和TNF-α显著下降[11]。灸温差异产生不同生物学效应的分子机制是研究的热点。43℃是瞬时受体电位香草酸阳离子通道1(TRPV1)的激活温度，有学者发现[12]，在皮肤局部涂抹辣椒素能提高炎症痛小鼠痛阈，这说明TRP信号通路参与了炎症痛过程，而进一步在局部使用辣椒素受体拮抗剂能削弱针灸的镇痛作用，TRPV1参与艾灸的镇痛过程，但其中的机制仍有待进一步研究。本研究发现，艾灸治疗从第10d开始逐渐产生消肿作用，而艾灸的镇痛作用在治疗的第8d即出现，说明艾灸的镇痛作用与抗炎机制可能存在不同的神经生理学基础。最新研究[13]揭示了电针通过激活迷走-肾上腺皮质轴产生强大的抗炎作用。本研究肯定了艾灸的抗炎镇痛作用，并且对小鼠全身炎症指标有抑制，这可能是艾灸抗炎的重要作用机制，但其内在联系尚需进一步研究验证。