人烯醇化酶1在原核细胞中的可溶性表达及纯化*

金科华，向念慈，刘 洋

(1.湖北科技学院医学部基础医学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院医学部药学院)

正常细胞在氧气供应充足时，采用氧化磷酸化为其提供能量。旺盛生长的肿瘤细胞即使氧气充足，也进行旺盛的糖酵解，并为其提供ATP和合成核苷酸的原料，这一特点称为Warburg效应[1]。糖酵解途径的抑制剂已有良好的抗肿瘤作用[2-5]。烯醇化酶1(ENO1)是糖酵解通路的重要酶，催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸。已发现ENO1在肺癌、结肠癌、卵巢癌等癌细胞中高表达[6-9]，已成为不少肿瘤细胞的诊断标志物和治疗靶点[10]。抑制ENO1能干扰卵巢癌等肿瘤细胞的生长[11-12]。本研究旨在利用重组DNA技术，在原核细胞中表达和纯化ENO1，为建立ENO1抑制剂筛选模型奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料

ENO1 cDNA(厦门大学韩家淮院士馈赠)；质谱纯引物、卡那霉素、IPTG、DNA相关操作试剂盒(生工生物工程股份有限公司)；限制性核酸内切酶(NEB公司)；大肠杆菌、DNAMarker(北京全式金生物技术公司)；DNA聚合酶、DNA连接试剂盒(TaKaRa公司)；可溶性His标签蛋白纯化试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)；蛋白质marker(Thermo Scientific公司)；BCA蛋白质定量测定试剂盒(Bio-sharp公司)；15mL截流分子量10KD超滤管(Millipore公司)。其余试剂为国产分析纯，实验仪器略。

1.2 扩增ENO1 cDNA

用Snapgene软件设计扩增ENO1 cDNA的上游引物PF：CACCATATGATGTCTATTCTCAAGATCCATGC；下游引物PR：ATCCTCGAGTTACTTGGCCAAGGGGTTTCTG。前三个字母是保护碱基，下划线处分别为限制酶Nde I和Xho I位点。

将含ENO1 cDNA的菌液于37℃，260r/min培养24h，再按1∶100接种至含100μg/mL氨苄青霉素的LB，同法培养过夜，用柱式质粒小量提取试剂盒制备含ENO1 cDNA的质粒，按表1和2 PCR扩增ENO1 cDNA。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶回收纯化。

表1 PCR体系

表2 PCR参数

1.3 酶切、连接与转化

表3酶切ENO cDNA、pET-28a。用琼脂糖凝胶电泳分离酶切的cDNA、质粒pET-28a，并用试剂盒回收纯化。取酶切的cDNA、pET-28a各2.5μL与5μL Solution I混合，16℃连接1h。连接产物热激法转化Top10感受态细胞，于含100μg/mL卡那霉素的LB平板(LBK培养基)筛选抗性菌落。

表3 酶切ENO1 cDNA、pET-28a及pET-28a-ENO1

1.4 鉴定重组质粒

按表3酶切重组质粒pET-28a-ENO1和空质粒pET-28a，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物。酶切鉴定与ENO1 cDNA分子量相符的重组质粒送华大基因测序。

1.5 表达与纯化ENO1

按方法1.3将pET-28a-ENO1转化BL21(DE3)细胞，用接种针取一个单菌落接种于4mL LBK培养基，37℃ 260r/m培养过夜，作种子液。将1.5mL种子接种于150mL LBK培养基，平行接种两份，37℃ 260r/m培养至OD600约0.7，一份加入终浓度0.2mmol/L的IPTG，另一份加蒸馏水作为对照，16℃ 260r/m培养24h。12 000r/min 4℃离心3min，收集菌体，称重，按每克菌体加10mL蛋白抽提缓冲液(含1mmol/L PMSF)的比例，重悬菌体。以260W超声10s停10s的程序，裂解菌体1h。裂解液于12 000r/min，4℃离心15min，取上清。预留120μL裂解液上清用于SDS-PAGE检测。将上清与等体积Binding Buffer混合。向50mL离心管中加入3mL纯化填料，12 000r/min，4℃离心2min，弃上清。用5倍体积的超纯水重悬，洗涤残留乙醇，12 000r/min，4℃离心2min，弃上清。重复洗涤一次。用5倍体积的Binding Buffer重悬填料，12 000r/min 4℃离心重悬的填料5min，弃上清。将混合后的上清液与填料4℃混匀10min，12 000r/min 4℃离心5min，吸走上清。20mmol/L咪唑洗涤：向离心管内加入20mL含20mmol/L咪唑的Binding Buffer，4℃混匀5min，12 000r/min 4℃离心5min，取上清，重复此步2次，合并洗涤液，记为洗涤液1。40mmol/L咪唑洗涤：同法用含40mmol/L咪唑的Binding Buffer，洗涤填料3次，合并洗涤液，记为洗涤液2。500mmol/L咪唑洗脱：用60mL含500mmol/L咪唑的Binding Buffer洗脱ENO1，合并洗脱液。

洗脱的ENO1加入截留分子量(molecular weight of cut off，MWCO)10KD的超滤管，4 000×g 4℃离心浓缩至1.5mL，加入10.5mL pH7.2的PBS稀释浓缩液，混匀，再次离心浓缩至1.5mL，重复稀释—浓缩步骤10次，最后将ENO1浓缩至4mL。

取浓缩后的ENO1 10μL，用PBS稀释20倍，BCA试剂盒测定浓度。向ENO1浓缩液加入终浓度2mmol/L的PMSF，与等体积无菌甘油混匀，分装，保存于-20℃。

1.6 SDS-PAGE鉴定表达产物

向方法1.5中预留的120μL裂解液上清、浓缩后稀释20倍ENO1中各加入30μL 5×SDS-PAGE Loading Buffer，混匀，98℃变性10min。将蛋白Marker和诱导及未诱导的裂解液各2μL(分别与8μL 1×Loading混匀)、稀释的ENO1 10μL上样于SDS-PGAE胶(10%分离胶)。于80V 30min，120V 50min电泳分离。用考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，室温染色30min。回收染色液，用超纯水洗涤，将凝胶浸泡于超纯水，微波炉中煮沸脱色5min，弃脱色液。重复煮沸脱色5次，直至背景干净，条带清晰。

2 结 果

2.1 ENO1 cDNA的PCR扩增

PCR产物的电泳鉴定结果如图1，泳道2中最亮条带的分子量位于1 200～1 400bp，与ENO1 cDNA大小(1305bp)相符(2泳道)，阴性对照无扩增条带(3泳道)，可见ENO1 cDNA扩增成功。2泳道亮带下方有一亮度较弱的条带为非特异性扩增产物，底部200bp左右的条带可能为引物二聚体。

1:200bp DNA Ladder；2:ENO1 cDNA PCR产物；3:阴性对照PCR产物

2.2 重组质粒的鉴定

酶切鉴定结果见图2，重组质粒pET-28a-ENO1和空质粒pET-28a(5369bp)经Nde I+Xho I酶切后皆有介于5000～6000bp的条带(2、3泳道)，前者产生的1000～2000bp小片段与ENO1 cDNA分子量(1305bp)相符(3泳道)，后者无此条带。可见，PCR产物已重组至pET-28a质粒中。

1:1kb DNA Ladder；2:pET-28a Nde I+Xho I 酶切产物；3:pET-28a-ENO1 Nde I+Xho I 酶切产物；4:Trans2KDNA Marker

pET-28a-ENO1的测序结果如图3所示(仅展示一部分)，DNAman软件比对显示连入pET-28a中的序列与ENO1 cDNA碱基序列一致，无突变。蓝色下划线序列为载体pET-28a中的Nde I位点，红色箭头序列为ENO1的起始密码子编码序列，箭头指向ENO1 cDNA的3′端。

图3 pET-28a-ENO1序列测定

2.3 ENO1的表达与纯化

ENO1的SDS-PAGE鉴定结果如图4。pET-28a-ENO1-BL21(DE3)经0.2mmol/L IPTG诱导后，上清中有一丰度最高的蛋白，位于40～55Ku(3泳道)，与ENO1分子量(47Ku)一致，可知重组菌表达了可溶性ENO1。经Ni2+纯化的ENO1(4泳道红色箭头所示)纯度高，杂带少。ENO1经浓缩和更换缓冲液后，浓度约为16mg/mL，故150mL菌液经0.2mmol/L IPTG诱导后，获得64mg纯化的ENO1。由此计算，ENO1的表达量约为427mg/L。未经IPTG诱导的菌体也有一条较浓且与ENO1分子量相近的条带(2泳道红色虚线箭头所示)，疑为本底水平表达的ENO1，但未能纯化到ENO1，可见此带为大肠杆菌BL21(DE3)内源表达的其他高丰度蛋白。

1:Protein Marker;2:pET-28a-ENO1-BL21(DE3)未经IPTG诱导的上清；3:pET-28a-ENO1-BL21(DE3)0.2mmol/L IPTG诱导后的上清;4:上清中纯化的ENO1

3 讨 论

本文构建了ENO1原核表达载体pET28a-ENO1。基因工程菌pET28a-ENO1-BL21(DE3)经0.2mmol/L IPTG诱导，表达了可溶性的ENO1，经组氨酸标签蛋白纯化试剂盒纯化，ENO1产量达427mg/L。

组氨酸标签蛋白纯化试剂盒多采用调节洗涤液和洗脱液的流速来纯化重组蛋白，这种操作虽然合理，但耗时长。本文用离心—取上清的方法取代上述法洗涤和洗脱重组蛋白，简化了操作，极大缩短了纯化时间，获得了高纯度的ENO1。

考马斯亮蓝染色的凝胶通常用含甲醇(或乙醇)和醋酸的脱色液来脱色，甲醇和醋酸有强烈的刺激性气味，对操作者有害，污染环境，用量大，成本高。本文采用的水煮法脱色，无需使用任何试剂，有缩短时间、降低成本、利于环保的三重优势，可供同行参考。

ENO1催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，不易检测的磷酸烯醇式丙酮酸可被丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)转化为丙酮酸，同时生成ATP。在氧气存在时，ATP和荧光素可被荧光素酶催化反应[13]，产生荧光，荧光强度与ATP浓度成正比，故可通过测定荧光强度来间接测定ENO1的酶活性。笔者正着手构建PK和荧光素酶表达载体、生产PK和荧光素酶，通过三酶偶联法建立基于分光光度法的ENO1抑制剂筛选模型。