多光谱法对环境雌激素孕酮与牛血清白蛋白的相互作用研究*

王智俊，刘东亮，付娌丽，饶 璐，李月生

(1.湖北科技学院医学部药学院，湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院辐射化学与功能材料湖北省重点实验室;3.咸宁市高新水凝胶敷料产业技术研究院)

孕酮分子式为C21H30O2，分子量为314.46，CAS:57-83-0，属于天然孕酮类药物，为环境雌激素孕酮(environmental estrogens progesterone，EEP)[1]，该物质作为促生长剂常在饲料中添加。但最近的研究结果表明[2]，食用含有这类激素的食物，可能会扰乱人体内分泌，会致癌、致畸和导致其他严重疾病，有关部门目前出台相关规定禁止在食品中添加该激素。因此，研究环境雌激素的生物安全性和污染控制与治理迫在眉睫[3]。

血清白蛋白是人和动物血液中含量最多、纯度最高的蛋白质，也是血浆中最丰富的药物递送载体。EEP一旦被人食用，可通过与血清白蛋白相互作用输送到体内，对人体造成危害[4]。因结构上和人血清白蛋白的相似性，牛血清白蛋白(BSA)被广泛运用于与药物结合作用的研究，是目前研究最典型和最理想的蛋白质之一[5]。

早期关于孕酮的报道主要集中在医药、食品、农业等领域，尤其在免疫学检测中。但是目前利用光谱学方法研究孕酮与血清白蛋白相互作用机理和结合模式的报道很少。本研究工作的主要思路是：在近生理条件下，利用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱法等多光谱方法，研究EEP与BSA的相互作用机理，从而获得它们之间的荧光猝灭机理、结合位点等重要信息；此外，我们通过位点竞争实验研究EEP在BSA上的作用位点。这些研究为今后环境激素的安全性评价和污染控制提供了一定的理论支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 试剂

牛血清白蛋白(BSA含量>96%，美国莫克公司)；华法林和布洛芬由南京中信化学有限公司提供；孕酮(美国莫克公司)。实验用水全部为双蒸水。

1.1.2 仪器

F-2500型荧光光度计(日本日立公司)恒温系统；TU-1810紫外可见分光光度计(北京浦肯捷通用仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 EEP与BSA的相互作用机理

制备0.01mol/L、pH=7.4的磷酸盐缓冲液，用该缓冲液进一步制备2×10-6mol/L BSA溶液。测定血清蛋白物质中溶液与孕酮药物溶液浓度比为1∶1时的紫外-可见吸收光谱。在298K、304K和310K温度下，用微量注射器将3.0mL BSA和不同浓度比的孕酮溶液加入石英比色皿中，然后测量荧光光谱。荧光发射和激发狭缝宽度设置为5.0nm，波长扫描速度为1200nm/min，激发波长为285nm，记录范围为300～450nm。

1.2.2 EEP与BSA的结合位点

位点竞争实验：BSA与布洛芬(或华法林)的浓度比为1∶1，在BSA-布洛芬或BSA-华法林体系中加入一定体积的药物溶液，测定荧光光谱，激发波长为285nm，记录范围为300～450nm。

2 结 果

2.1 EEP与BSA相互作用的荧光猝灭机理和猝灭常数

BSA分子在一定波长的紫外光激发下会发出强烈的内源性荧光，内源性荧光主要来自酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)[6]。为了减少酪氨酸和苯丙氨酸的影响，本研究选择激发波长为285nm，使BSA的荧光主要来自色氨酸残基。

从图1a可以看出，固定BSA蛋白浓度，向其中加入EEP，随着EEP浓度的升高，BSA的内源荧光产生规律性猝灭。表明荧光猝灭可能来自EEP和BSA之间更强的相互作用。

猝灭机理通常分为静态或动态猝灭[7]。静态猝灭是猝灭剂和荧光分子在基态不产生荧光，导致荧光强度降低的过程，而动态猝灭是由于猝灭剂和荧光物质激发分子态之间的相互作用引起的。对于动态猝灭，强度的降低通常使用Stern-Volmer方程进行分析[8]：

(1)

式中F0为未加猝灭剂时的稳态荧光强度，F为加入猝灭剂时的稳态荧光强度，[Q]为猝灭剂浓度，τ0为猝灭剂不存在时的荧光分子平均寿命，对于生物大分子，τ0=10-8s,kq分别为双分子猝灭速率常数，KSV为Stern-Volmer猝灭常数。

用F0/F对[Q]处理结果，得到化合物对BSA的猝灭常数。通过改变温度可以看出温度对猝灭常数的影响。由于动态或静态猝灭过程，F0/F与[Q]之间存在线性关系。动态猝灭取决于扩散，扩散系数会随着温度的升高而增大，因此，荧光材料的猝灭常数也会随着温度的升高而增大。但静态猝灭中，温度升高会导致正常化合物的稳定性下降，因此，猝灭常数反而会随着温度的升高而减小。依据猝灭常数的增大或减小可以推断出荧光猝灭过程属于静态或动态猝灭。

图1b由线性拟合图得到，从图中可以看出，EEP-BSA系统的Stern-Volmer曲线中F0/F与[Q]呈现出良好的线性关系，不同温度条件下KSV值随着温度的升高逐渐增大。同时，化合物的Stern-Volmer猝灭常数的增加表明，孕酮和BSA之间的荧光猝灭不是由于猝灭剂和荧光分子在正常状态下产生荧光复合物，而是荧光激发分子之间相互作用的一个动态猝灭过程。

为了进一步验证EEP和BSA之间的猝灭机理是动态猝灭，我们通过紫外-可见吸收光谱法测试了孕酮和BSA之间的相互作用。动态猝灭只影响荧光分子的激发态，不会改变荧光材料的吸收光谱，但基态配合物的形成往往会导致荧光材料吸收光谱的变化[9]。从图1c可以看出，曲线A在250nm处与曲线D基本重合，表明添加EEP后，BSA的紫外-可见吸收光谱没有明显变化，荧光猝灭来自EEP和BSA之间的激发态分子相互作用。实验结果进一步证实了反应体系的猝灭机理为动态猝灭。

图1 EEP与BSA相互作用

2.2 EEP和BSA的结合

根据荧光共振能量转移(FRET)，猝灭的程度取决于蛋白质(供体)和猝灭剂之间的距离和能量转移效率：

(2)

E是类型(2)中供体和受体之间的能量转移效率。F0为未加猝灭剂时的稳态荧光强度，F为加入猝灭剂时的稳态荧光强度，r为供体与受体之间的距离，R0为临界能量转移距离。

(3)

K2是偶极空间取向因子，n是介质的折射指数，Φ为给体的荧光量子产率，J是给体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱间的重叠积分，可由下式计算：

(4)

式(4)中，F(λ)为荧光给体在波长λ处的荧光强度，ε(λ)为受体在波长λ处的摩尔吸收系数。

图2显示EEP和BSA的摩尔比为1∶1，EEP的吸收光谱和BSA的荧光光谱重叠。图谱重叠部分由公式(4)计算，得出J为1.145×10-14cm3·L·mol-1。

图2 EEP紫外-可见吸收光谱(A)与BSA荧光光谱(F)的重叠图

实验条件下，K2=2/3，n=1.336，因为在BSA中荧光主要来自色氨酸，而色氨酸量子产率Φ为0.118，将这些值代入公式(3)中，可计算出临界距离R0=2.5nm，由公式(2)可知BSA与EEP之间的能量转移效率E为0.052，取决于R0和E的值，由公式(2)计算得到BSA色氨酸残基与结合EEP的距离r为4.05nm。计算结果符合2～8nm之间的能量转移理论，表示两者形成了复合物，且结合紧密。

2.3 EEP与BSA作用力的类型

动态猝灭模式反应的热力学参数是通过计算活化能得到的。活化能是化学动力学中一个非常重要的概念，它说明了反应所需的最小能量。Arrhenius方程可用于计算荧光猝灭过程中的活化能：

(5)

式(5)中，Ksv为动态猝灭速率常数，Ea为猝灭过程的活化能，A为频率因子，R为气体常数。当温度变化时，活化能可以看作是一个常数。lnKsvvs l/T作图，发现了良好的线性关系，计算出的Ea参数列于表1，EEP与BSA相互作用的活化能为35.38kJ/mol。

表1给出了动态猝灭常数(Ksv)和活化能(Ea)等参数，从表1可以看出猝灭常数Ksv随温度升高而增大，说明EEP和BSA的作用是一种吸热反应，即焓变ΔH>0；反应是自发的，因此，反应的自由能ΔG<0，表示熵变ΔS>0。EEP和BSA的作用是熵驱动的自发过程，但系统的焓变不利于自发过程，两者主要靠疏水作用力相结合。

表1 EEP-BSA体系的猝灭常数Ksv和活化能Ea

2.4 EEP与BSA的结合位点

为了确定EEP在BSA中的结合位点，据报道[10]，分别选择华法林(Warfarin)和布洛芬(Ibuprofen)作为位点Ⅰ和位点Ⅱ的标记物。两者分别被添加到EEP-BSA系统中。选择285nm作为激发波长，逐渐增加体系中EEP的浓度，然后评价在BSA中加入不同浓度EEP的光效应。实验结果表明，随着EEP的加入，BSA的荧光呈现出规律的猝灭。从图3可以看出，在EEP-BSA反应体系中加入布洛芬后(图3a-1)，实验组与对照组相比荧光强度变化不明显，而加入华法林后(图3a-2)，与对照组相比，实验组荧光强度明显减小。综合以上结果表明，反应体系荧光强度的变化主要是华法林占据了EEP-BSA结合的位置。

为了进一步比较华法林和布洛芬对EEP-BSA体系的影响，采用Stern-Volmer方程(1型)对实验数据进行分析(如图3b)，结果表明两者的加入对反应体系的猝灭常数有影响，加入华法林标记物对反应体系猝灭常数的影响明显大于布洛芬。得出的结论是华法林和EEP竞争同一位点，EEP和BSA位点主要出现在位点Ⅰ(子域ⅡA)。

图3 EEP与BSA的结合位点

3 讨 论

在近生理条件下，利用多光谱方法研究EEP与BSA的相互作用机理，有效获得了这两者间的荧光猝灭机理、结合常数、作用力类型、结合位点位点等信息。结果表明：首先，EEP-BSA系统的Stern-Volmer曲线中F0/F与[Q]呈现出良好的线性关系，猝灭常数Ksv值随着温度的升高逐渐增大，EEP和BSA之间为动态猝灭。其次，计算得到BSA与EEP结合过程中，BSA色氨酸残基与EEP的结合距离r为4.05nm，符合2～8nm之间的能量转移理论，表示两者形成了复合物且结合紧密。此外，EEP和BSA的作用是熵驱动的自发过程，两者主要靠疏水作用力相结合。最后，EEP和BSA之间的相互作用主要发生在子域ⅡA中的位点Ⅰ。

本工作对研究环境雌激素与生物大分子的相互作用机理非常有帮助，可为今后生物相容性测定、生物安全性评价和环境激素污染治理等提供一定的理论指导和实践参考。