蝙蝠葛碱对恶性胶质瘤U87细胞的抑制及分子机制研究*

张晓雯，徐康彦，王帮华，胡美纯**

(1.湖北科技学院医学部药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院医学部基础医学院)

神经胶质瘤(glioma)是最常见的中枢神经系统肿瘤，约占全部颅内肿瘤的40%～50%[1]。根据肿瘤恶性程度划分成Ⅰ～Ⅳ等级，其中生长最快、恶性程度最高、最难以治愈的肿瘤亚型为胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)，属于IV级恶性胶质瘤，可侵袭脑或脊髓的邻近细胞，肿瘤为浸润性且发展迅速[2]。尽管目前有手术切除、化疗和放疗等多种治疗方法，晚期胶质瘤患者的平均中位生存期仍然不足15个月，仅有3.3%的GBM患者存活超过两年。随着GBM发病的分子机理不断阐明，许多小分子靶向化疗药物得以研发并应用于临床[3]。然而，现有临床实践表明影响多数胶质瘤患者化疗效果的最主要原因之一就是血脑屏障的阻碍，以及肿瘤细胞的异质性和耐药性，最终导致预后不良[4]。开发治疗胶质瘤的新药具有极大的理论研究意义和临床应用价值。

蝙蝠葛碱(dauricine，Dau)是从山豆根的根茎中提取分离的双苄基四氢异喹啉生物碱，具有较高的脂溶性，易透过血脑屏障。蝙蝠葛碱最早用于抗炎和抗心律失常的治疗；近年来研究表明其对结肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌细胞均具有抑制作用[5]。本研究的目的是用体外实验分析胶质瘤细胞生长和凋亡规律，确定蝙蝠葛碱对胶质瘤细胞增殖和凋亡相关蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

人脑星型胶质母细胞瘤U87细胞株购自美国模式菌种收集中心ATCC细胞库。

1.1.2 主要试剂

DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司；二甲基亚砜、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶购于美国Gibco公司；青链霉素购于吉诺医药生物技术有限公司；BCA蛋白定量试剂盒、结晶紫、RIPA裂解液、PMSF、Cocktail、磷酸化蛋白酶抑制剂、ECL发光试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；脱脂奶粉购于美国BD公司；MTT、Tris碱、Glycine、SDS、牛血清白蛋白、甘油、甲醇、溴酚蓝、40%丙烯酰胺、TEMED等试剂购自上海生工生物；NC膜(Millipore)、过硫酸铵(Sigma-Aldrich)、胎牛血清(Gibco)、100×青霉素+链霉素混合液P/S(Invitrogen)购自湖北妙威生物医药公司；p53抗体(#9282，Cell Signaling Technology)、Bax抗体(#2774，Cell Signaling Technology)、Bcl-2抗体(YY0032R，Abbkine)、切割型Caspase-3抗体(ab32042，Abcam)、切割型PARP抗体(ab32064，Abcam)、β-Actin抗体(#A5441，Sigma-Aldrich)购自武汉蜂鸟生物科技有限公司；蝙蝠葛碱购于上海源叶生物科技有限公司(HPLC检测纯度98%以上)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将U87接种于含10%胎牛血清和1%双抗(青霉素+硫酸链霉素)的DMEM高糖培养基，放置于5%CO2的37℃细胞培养箱中。待细胞生长至85%时传代，收集对数期细胞进行实验。

1.2.2 细胞存活率实验(MTT法)

取对数期生长的U87细胞，调整细胞浓度为5×104/mL接种于96孔板内，每孔100μL，置于培养箱中孵育至细胞单层铺满孔底，加入浓度梯度(0、2.5、5、7.5、10、15、20μmol/L)的蝙蝠葛碱溶液作用48h。每孔加10μL 0.5%MTT溶液，继续培养4h后，弃去培养液，每孔加150μL二甲基亚砜，室温摇床低速振荡10min，使甲瓒结晶物充分溶解。酶标仪490nm处检测各孔吸光度值。

1.2.3 细胞克隆形成实验

取对数期生长的U87细胞，消化重悬，按每孔2×103接种于6孔板中，培养24h后，分别加入含0、2、4μmol/L蝙蝠葛碱的培养基，培养7～14d，每两天观察1次，至集落形成。弃去培养液，PBS洗3遍，用4%的多聚甲醛固定细胞15min，PBS洗3次，0.1%的结晶紫溶液染色10min，冲洗，晾干。在自然光照下用数码照相机拍摄白光明场照片。

1.2.4 细胞凋亡实验

取对数期生长的U87细胞，调整细胞浓度为5×104/mL接种于96孔板内，每孔100μL，置于培养箱中孵育至细胞单层铺满孔底，分别加入浓度为0、1、10、20μmol/L的蝙蝠葛碱作用48h后显微镜明场拍照，检测蝙蝠葛碱对U87细胞形态的影响。再取对数期生长的U87细胞消化重悬，调整细胞数为3×105/mL，以每孔200μL的细胞悬液滴加到24孔板中的爬片上，放入培养箱培养过夜。弃去培养基，分别加入0、10、15、20μmol/L浓度的蝙蝠葛碱溶液，继续培养24h。弃去培养基，用PBS润洗，4%多聚甲醛固定10min后PBS洗涤3遍，避光加入Hoechst 33342染色液(P0133，碧云天)，室温孵育5min，PBS洗涤3遍。载玻片上滴一滴抗荧光猝灭剂，盖上贴有细胞面的爬片，OLYMPUS正置荧光显微镜下用UV激发光观察拍照。

1.2.5 Western blot

将不同浓度(0、5、7.5、10μmol/L)蝙蝠葛碱处理24h的U87细胞用预冷的PBS洗3遍，弃去洗液，每皿加适量裂解工作液(RIPA裂解液、PMSF、Cocktail、磷酸化蛋白酶抑制剂)，在冰上裂解10min，再用细胞刮刀收集，4℃ 12 000rpm离心15min，收集上清。用BCA试剂盒测定蛋白浓度并定量，按1∶5加入Loading buffer，100℃煮7min。制备SDS凝胶，每孔蛋白上样总量为40μg，进行电泳分离，调节恒压80V至溴酚蓝运动到浓缩胶与分离胶分界处，再调节电压为120V，待溴酚蓝到底部时终止电泳，进行转膜。转膜前将PVDF膜用甲醇浸泡激活，按照“三明治”法转膜。5%脱脂奶粉室温摇床1h封闭，一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10min，二抗室温孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min。在暗室里将ECL发光液滴在膜上，曝光显影。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 蝙蝠葛碱抑制神经胶质瘤U87细胞的增殖

用MTT法测试不同浓度(0、2.5、5、7.5、10、15、20μmol/L)的蝙蝠葛碱对U87细胞增殖能力的影响程度，结果如图1A所示。药物作用48h后，细胞活力随着药物浓度的增加呈现下降趋势，蝙蝠葛碱对U87细胞的增殖抑制IC50为15.792μmol/L。剂量5μmol/L和7.5μmol/L组与对照组相比均具有显著差异(P<0.05)，10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L组与对照组相比具有极显著差异(P<0.01)。当药物浓度达到20μmol/L时，抑制率接近90%。结果表明在48h时蝙蝠葛碱对U87细胞生长具有浓度依赖性抑制作用。

2.2 蝙蝠葛碱抑制U87细胞的克隆形成

由图1B可见，对照组U87细胞在培养10d后形成了大面积的细胞集落，反映出细胞增殖能力强，群体依赖性高。当蝙蝠葛碱浓度达到2μmol/L时，明显抑制了U87的克隆集落形成，抑制率上升至37.5%，当药物浓度为4μmol/L时，抑制率达到72.0%，抑制能力显著增强。与对照组相比，2μmol/L和4μmol/L的蝙蝠葛碱对胶质瘤细胞的克隆形成抑制能力都具有极显著差异(P<0.01)。结果表明，蝙蝠葛碱能显著抑制U87细胞的克隆形成。

(与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，n=3)

2.3 蝙蝠葛碱诱导U87细胞凋亡

我们将蝙蝠葛碱处理48h后的U87细胞进行白光明场拍照观察，可看到对照组U87细胞形态饱满、轮廓清晰、细胞核形大、细胞密度均匀并呈堆叠状排列。1μmol/L蝙蝠葛碱处理的U87细胞尚能维持正常形态，但当浓度增大到10μmol/L后，出现明显的细胞密度减小，细胞间隙增大，细胞形态也发生不同程度的异形变化，细胞大小不均一；当药物浓度达到20μmol/L时，大量细胞变圆死亡，上述细胞形态变化均符合细胞凋亡的形态特征(图2A)。我们推断蝙蝠葛碱具有诱导胶质瘤细胞凋亡的作用，为了验证此猜想，我们在荧光显微镜下对U87细胞进行Hoechst 33342染色(图2B)。实验结果显示，U87对照组的细胞核形态椭圆、边缘平整，核染色呈现暗蓝色。与对照组相比，10μmol/L蝙蝠葛碱给药组细胞首先出现活细胞数目减少，细胞核变大、染色质固缩、边缘模糊。随着给药浓度从10μmol/L增大到15μmol/L，U87细胞核形态更为显著，表现为核凹陷、褶皱、裂解，呈现核内致密深染。当蝙蝠葛碱浓度达到20μmol/L时，细胞大量死亡，细胞核破碎产生凋亡小体，颜色呈现亮白深染，证明随着蝙蝠葛碱给药浓度的升高，U87细胞发生了程度愈加明显的凋亡现象。

图2 Dauricine诱导U87细胞发生凋亡

2.4 蝙蝠葛碱对U87细胞p53、Bax、Bcl-2、Caspase-3和PARP蛋白表达的影响

我们用蝙蝠葛碱处理U87细胞24h，凋亡相关蛋白的表达水平发生了变化。Western blot(图3)显示促凋亡蛋白Bax的表达升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表达下降。另外我们还检测到切割型Caspase-3和PARP明显升高。在凋亡过程中p53起着重要作用：实验发现p53在蝙蝠葛碱的作用下表达显著上调。

图3 Dauricine对U87细胞中凋亡相关蛋白表达的影响

3 讨 论

中草药的植物成分天然小分子单体日益成为治疗各种肿瘤的重要化合物来源，中草药有效成分也已成为辅助胶质瘤治疗的一大探索方向[6-7]。蝙蝠葛碱就是来源于天然植物山豆根根茎中的生物碱，可透过血脑屏障。我们的实验探讨了蝙蝠葛碱在体外对胶质瘤细胞的影响，蝙蝠葛碱不仅显著抑制了胶质瘤细胞的增殖，也诱导U87细胞凋亡。Western blot分析结果显示，蝙蝠葛碱显著降低胶质瘤细胞中Bcl-2的表达水平，并增加Bax、p53、切割的PARP及Caspase-3的表达。

p53是重要的转录因子，也是重要的癌症治疗靶标，调控着肿瘤的发生和凋亡[8]。野生型p53活化后可以修复受损的DNA，参与细胞G1期阻滞，诱导细胞凋亡[9]。我们的实验结果显示随着蝙蝠葛碱药物浓度的升高，p53的表达也逐渐增强。p53转录后又可以激活下游的促凋亡蛋白Bax和Bak(“BH123”或“多结构域”蛋白质)，使线粒体外膜渗透，导致细胞色素c和其他蛋白质从膜内释放，启动线粒体凋亡途径；同时p53可以直接抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的转录[10]。我们的研究结果发现经蝙蝠葛碱处理后，Bax表达上升，Bcl-2表达下降。在细胞质中，细胞色素c与凋亡蛋白酶激活因子1相互作用，结合并激活Caspase-9，进而激活其下游Caspase-3前体蛋白产生切割型Caspase-3。后续我们将研究更深层次的信号通路并提供更有利的动物体内实验加以论证，为将蝙蝠葛碱开发成为治疗神经胶质瘤的小分子靶向药物提供理论依据和实验支持。