藏红花及其主要成分预防和治疗糖尿病炎症的作用机制*

鲍夏君，孙 甜，高旭政，张振旺**

(1.湖北科技学院医学部药学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室/医学部医药研究院)

全球糖尿病患病率大幅上升，2019年糖尿病患者人数为4.63亿，预计到2045年将达到7.002亿[1]。流行病学研究报道，临床Ⅱ型糖尿病患者的白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎性细胞因子水平明显升高[2-6]。糖尿病的治疗策略与多种因素有关，包括饮食、运动和药物治疗[7]。因此，可以考虑使用传统医学来预防、控制和治疗糖尿病[8-9]。藏红花，又名西红花、番红花，数千年来一直被作为传统药物的代表，其主要成分包括正庚醛(N-heptanal)、藏红花酸(Crocetin)、异鼠李素(Isorhamnetin)、山奈酚(Kaempferol)和槲皮素(Quercetin)。藏红花具有多种药理作用，包括抗氧化应激[10]、抗炎[10]和抗癌[11]等；研究表明藏红花可显著降低血糖水平和改善胰岛素抵抗[12-13]，并且藏红花具有抗炎特性，有研究表明藏红花可以抑制炎症因子如TNF-α和IL-1β等的转录[14]。

这些研究表明藏红花及其主要成分对糖尿病和炎症都发挥着重要的作用。然而，到目前为止，藏红花对糖尿病炎症的影响还没有以网络药理学系统研究和评估。我们通过网络药理学分析并测量IL-1β、IL-6和TNF-α等几种细胞因子的水平来评价藏红花在Ⅱ型糖尿病中炎症的影响，以系统地分析藏红花有效成分在Ⅱ型糖尿病中炎症的影响并量化这些关系。

1 材料与方法

1.1 检索藏红花治疗糖尿病的生物学靶点信息

通过DisGeNET数据库(http://www.disgenet.org/search)和GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)检索糖尿病相关靶基因。TCMSP数据库输入“藏红花”(http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索其主要成分，并进行条件筛选(OB≥30%，DL≥0.18)。通过CTD数据(http://ctdbase.org/detail.go?acc=C452899&type=chem)检索藏红花中主要成分的靶基因。DisGeNET、GeneCards和CTD数据库糖尿病相关靶基因取交集获潜在靶基因。运用STRING数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)绘制蛋白交互作用(PPI)网络关系图。

1.2 构建网络关系图并进行拓扑和聚类分析

用Cytoscape绘制网络关系图并进行数据分析，结合分析结果对靶基因进行筛选(Find Clusters:In Whole Network,Include Loops:No,Degree Cutoff:2,Haircut:Yes,Fluff:No,Node Density Cutoff:0.1,Node Score Cutoff:0.2,K-core:2,Max.Depth:100)。运用STRING数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)绘制蛋白交互作用(PPI)网络关系图，并用Cytoscape软件中的MCODE插件对网络关系图进行聚类分析。

1.3 生物学靶点富集分析

应用DAVID online(https://david.ncifcrf.gov/)功能富集分析和KEGG分析，并用Cytoscape绘制KEGG分析出的网络关系图。

1.4 ELISA检测炎症因子

糖尿病并发症动物模型联盟(AMDCC)(http://www.diacomp.org/shared/protocols.aspx)描述了小鼠遵循的糖尿病诱导方案。给予8周大的C57小鼠(苏州西山生物技术有限公司)多剂量(每24h，共5剂)链脲佐菌素(STZ)(柠檬酸盐缓冲液中的50mg/kg BW)。实验分组为：control组(正常小鼠)，control+Cro组(正常小鼠腹腔注射Crocetin)，DM组(糖尿病模型组)和DM+Cro组(糖尿病小鼠腹腔注射Crocetin)，在所有实验中使用10只动物/组。在STZ注射后1周和之后每周测量一次血糖和尿白蛋白，当空腹血糖≥11.1mmol/L，认为糖尿病模型成功。造模成功后，Crocetin(柠檬酸盐缓冲液中的50mg/kg BW)腹腔注射，连续注射一周后，眼球取小鼠全血样品后于室温放置2h，1000×g离心20min，取上清待测。分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μL，分别将样品或不同浓度标准品按照100μL/孔加入相应孔中，用封板膜(透明)封住反应孔，室温孵育120min。加入生物素化抗体100μL/孔(TNF-α试剂盒，碧云天，货号PT512；IL-6试剂盒，碧云天，货号PI326；IL-1β试剂盒，碧云天，货号PI301)。用封板膜封住反应孔，室温孵育60min。洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。加入辣根过氧化物酶标记Streptavidin 100μL/孔。用封板膜封住反应孔，室温避光孵育20min。室温偏低时(低于25℃)，需要适当延长孵育时间。洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。加入显色剂TMB溶液100μL/孔，用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育20 min。室温偏低时需要适当延长孵育时间，此时可以孵育至标准品和样品出现非常显著的颜色变化。加入终止液50 μL/孔，混匀后立即测量A450值，绘制标准曲线。以标准品浓度为横坐标，A450值为纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点，通过样品的吸光度值和标准曲线计算出样品的相应浓度。

1.5 统计学方法

采用GraphPad Prism 7.0软件分析数据，数据形式均以(平均数±标准差)表示，多组数据间比较以one-way ANOVA检验，两组数据之间采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 藏红花4种主要成分在糖尿病的潜在靶基因

DisGeNET和GeneCards数据库分别检索得到1267和12966个与糖尿病相关的靶基因。筛选这两个数据库的重叠基因，得到1149个糖尿病相关靶基因。TCMSP数据库检索得到藏红花中的70种成分，并进行条件筛选(OB≥30%，DL≥0.18)后获得5种(图1)，包括N-heptanal(Molecule ID：MOL001389)、Crocetin(PubChem CID:5281232)、Isorhamnetin(PubChem CID:5281654)、kaempferol(PubChem CID:5280863)和Quercetin(PubChem CID:5280343)。CTD数据库中分别检索得到Crocetin、Isorhamnetin、Kaempferol和Quercetin的14、54、167和4129个靶基因(未检索到N-heptanal相关靶基因)。筛选DisGeNET、GeneCards和CTD数据库的重叠靶基因，获得藏红花上述Crocetin、Isorhamnetin、Kaempferol和Quercetin 4种主要成分在糖尿病共有相关靶基因分别为12、35、75和525个(图2A)。藏红花4种主要成分在糖尿病共有相关靶基因647(除去重复基因后剩538)个，其中Crocetin、Isorhamnetin、Kaempferol和Quercetin 4种主要成分在糖尿病共有靶基因有Rela(是NF-κB的主要组成部分)、TNF-α和IL-6，Isorhamnetin、Kaempferol和Quercetin 3种主要成分在糖尿病共有18个靶基因，Crocetin、Kaempferol和Quercetin 3种主要成分在糖尿病共有5个靶基因(图2B)。分析藏红花4种主要成分在糖尿病的相关靶基因的网络关系图(图3A)，筛选得到171个潜在靶基因(图3B)，进一步浓缩潜在靶基因，获得12个潜在靶基因(图3C)。

图2 藏红花主要成分在糖尿病中的共有靶基因

图3 藏红花主要成分在糖尿病作用靶点网络关系图

2.2 藏红花4种主要成分在糖尿病治疗的潜在信号通路

对藏红花4种主要成分在糖尿病的171个潜在靶基因的网络关系图进行聚类分析(图4A、B、C、D)。聚类分析结果显示共得到4个关联非常紧密的集群：Cluster 1∶score=59.014，Nodes=72，Edges=2095(图4A)；Cluster 2∶score=13.156，Nodes=46，Edges=296(图4B)；Cluster 3∶score=6.000，Nodes=27，Edges=78(图4C)；Cluster 4∶score=3.273，Nodes=12，Edges=18(图4D)。这4个集群的KEGG分析结果(图4E、F、G、H)显示PI3K-AKT、MAPK、HIF、TNF、FoxO和IL-17等炎症相关信号通路在多个集群中出现。

图4 藏红花4种主要成分在糖尿病的潜在靶基因聚类分析和KEGG分析

2.3 藏红花4种主要成分集群在糖尿病治疗的潜在生物功能

藏红花4种主要成分在糖尿病538个靶基因聚类分析显示关联非常紧密的集群，将集群进行GO分析结果显示，其在糖尿病中的生物过程主要包括：凋亡过程、对凋亡的调节、防御反应、对含氧化合物的反应、活性氧代谢过程、炎症反应、对细胞因子的反应、基因表达和蛋白质代谢的正向调控、细胞活化、蛋白质修饰过程的调控、细胞能量代谢过程(包括能量储备、葡萄糖代谢和多糖代谢)等(图5上)。4个集群在糖尿病中的细胞成分主要包括：分泌囊(包括分泌颗粒、囊泡腔)、细胞膜外部封装结构(膜微域、膜侧)、RNA聚合酶Ⅱ转录调控复合物、染色体(包括染色质)、血小板α颗粒腔、细胞器内膜(滑面内质网、线粒体、包涵体、内质网膜的内在成分)、细胞基板连接(胶原蛋白、细胞间小管)、中等密度脂蛋白颗粒、受体复合物(脂多糖受体复合物)等(图5中)。4个集群在糖尿病中的分子功能主要包括：受体调节器活动(信号受体结合、细胞因子受体结合)、蛋白结合(酶结合、含有复合结合的蛋白质、蛋白结构域特异性结合、SH3域绑定、载脂蛋白绑定、蛋白脂复合体结合、伴侣蛋白绑定和热休克蛋白结合等)、细胞因子活性、生长因子活性、DNA转录因子结合、化学引诱物的活动、蛋白激酶活性、激素绑定、抗氧化活性、胰岛素约束等(图5下)。

图5 藏红花的4种主要成分基因集群在糖尿病中的主要生物功能

2.4 藏红花4种主要成分对糖尿病炎症因子具有抑制作用

已知Crocetin、Isorhamnetin、Kaempferol和Quercetin四种主要成分在糖尿病的共有靶基因Rela(是NF-κB的主要组成部分)、TNF-α和IL-6，所以使用STZ构建小鼠糖尿病模型，选取藏红花主要成分Crocetin处理糖尿病小鼠，ELISA方法检测小鼠各组血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，结果显示Crocetin具有显著抑制炎症因子的作用，IL-1β、TNF-α和IL-6等炎症因子为藏红花治疗糖尿病的关键靶基因(图6)。

图6 藏红花酸对糖尿病小鼠炎症因子的抑制作用

3 讨 论

本文研究目的是探索藏红花主要成分Crocetin、Isorhamnetin、Quercetin和Kaempferol在糖尿病的抗炎作用及其所涉及的潜在分子机制。糖尿病是一个重要的医学问题，它可以导致慢性全身炎症，而这种慢性炎症还会导致糖尿病的长期并发症，包括非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、视网膜病变、心血管疾病和肾病等，并且可能导致Ⅱ型糖尿病与其他疾病(如阿尔茨海默病、多囊卵巢综合征、痛风和类风湿性关节炎)。藏红花作为一种中草药，含有藏红花酸、黄酮类化合物和藏红花素等多种活性成分，能有效调节氧化应激和炎症反应，在降低糖尿病的影响方面发挥主要作用。

我们分析了藏红花有效成分与Ⅱ型糖尿病疾病之间的网络关系，如：藏红花有效成分与糖尿病相关因子之间的靶向关系，藏红花有效成分通过聚集分析获得4个关联非常紧密的集群，进一步分析获得4个集群在糖尿病中的生物过程包括：凋亡过程、活性氧代谢过程、炎症反应等；4个集群在糖尿病中的细胞成分主要包括：细胞器内膜(滑面内质网、线粒体、包涵体、内质网膜的内在成分)、中等密度脂蛋白颗粒、受体复合物(脂多糖受体复合物)等；4个集群在糖尿病中的分子功能主要包括：DNA转录因子结合、化学引诱物的活动、蛋白激酶活性、抗氧化活性、胰岛素约束等。本研究显示藏红花的主要成分Crocetin、Isorhamnetin、Quercetin和Kaempferol可能通过调节NF-κB、TNF-α和IL-6等炎症因子抑制糖尿病炎症反应，且ELISA实验证实藏红花酸能显著抑制糖尿病IL-1β、TNF-α和IL-6等炎症因子。

综上所述，本研究结果表明，藏红花有效成分Crocetin、Isorhamnetin、Quercetin和Kaempferol可通过糖尿病的多靶点、多通路联合作用初步探索藏红花治疗糖尿病的潜在机制。通过网络药理学分析，藏红花可能通过共有靶基因(NF-κB、TNF-α和IL-6)、炎症相关信号通路(PI3K-AKT、MAPK、HIF、TNF、FoxO和IL-17)、生物过程(凋亡过程、防御反应、活性氧代谢过程和蛋白质代谢等)、细胞成分(分泌囊、细胞器内膜、中等密度脂蛋白颗粒和受体复合物等)、分子功能(信号受体、蛋白结合、蛋白结构域、细胞因子、生长因子、DNA转录因子、化学引诱物、蛋白激酶、激素绑定、抗氧化、胰岛素约束等)等途径参与糖尿病的治疗。最后我们通过ELISA检测了糖尿病小鼠血液中炎症因子水平，结果表明，藏红花酸能显著降低IL-1β、TNF-α和IL-6的水平。IL-1β、TNF-α和IL-6可能是藏红花治疗糖尿病的潜在靶点。这些结果提示藏红花的抗糖尿病炎症作用可能与其对上述潜在靶点和通路的直接或间接调控有关，为藏红花在DM炎症治疗中的临床应用提供了理论基础和研究思路。