基因靶向治疗糖尿病的研究进展*

谢紫洁，王高强，卯明艳，余开湖，2**

(1．湖北科技学院医学部，湖北 咸宁 437100;2．咸宁市中心医院/湖北科技学院附属第一医院)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是21世纪难治性疾病发病率和死亡率的主要原因，预计到2030年将影响5亿多人[1]。目前全球已经有多达十亿人罹患慢性高血糖，形成了重大的全球公共卫生问题。据最新数据[2]表明，2021年全球20～79岁人群的糖尿病患病率估计为10.5%(5.366亿人)，到2045年将上升至12.2%(7.832亿人)；2021年，全球与糖尿病相关的卫生支出估计为9 660亿美元，预计到2045年将达到10 540亿美元。糖尿病主要分为两种类型：1型糖尿病(type 1 diabetes,T1DM)和2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)。目前基因靶向治疗已被应用于对囊肿性纤维化、心血管疾病及糖尿病在内的各种疾病的研究，人们也开发了控制靶基因表达的细胞类型、时间和可逆性的方法，并有望在未来应用在糖尿病的临床基因靶向治疗上。

1 基因靶向治疗糖尿病现状

基因治疗是将治疗性遗传物质转移到特定的靶细胞，通过调节特定蛋白质的表达以预防或治疗疾病。最初的方法是基因过表达，其主要是通过转基因注入卵母细胞，传统的方法则是使用胚胎干细胞进行基因敲除。对基因靶向研究的首次实验是观察纯化的DNA对肺炎链球菌的遗传转化[3]。

目前国内外对糖尿病基因靶向治疗的研究主要针对T1DM、T2DM以及糖尿病并发症，研究人员通过对相关靶基因和靶点的研究以及基因靶向治疗糖尿病的载体进行了一系列的研究和探索[4-5]。而在糖尿病的基因靶向治疗中，单靶点治疗往往不能有效控制住机体血糖水平和并发症，目前研究人员也越来越关注多靶点联合治疗糖尿病上[6]。然而还需要一种技术可以有效靶向转染治疗糖尿病，一系列基因靶向递送系统也应运而生，其中超声介导载基因微泡技术已经广泛应用于包括糖尿病在内的多种疾病中，并且取得了良好的治疗效果[7]。

2 基因靶向治疗糖尿病载体的选择

2.1 病毒载体

目前广泛用于基因导入细胞的病毒载体包括复制缺陷型腺病毒、逆转录病毒、腺相关病(adenovirus-associated virus,AAV)和单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)。复制缺陷型腺病毒载体是目前最常用载体，其可以将编码免疫调节蛋白的基因导入完整的胰岛[8]。与腺病毒类似，逆转录病毒在体内和体外也被广泛用作基因转移载体，当给链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠模型注射重组胰岛素基因的逆转录病毒时，研究发现在肝细胞中表达了胰岛素并使机体达到正常血糖浓度。然而肝细胞不是增殖细胞，所以需要肝切除术诱导肝细胞增殖，以确保有效的逆转录病毒感染效率[9]。逆转录病毒慢病毒属还包括人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)，可以感染非分裂和分裂细胞[10]。然而，在应用于人类之前，这些病毒的生物安全需要广泛研究。

是胰岛素基因传递的常用病毒载体腺病毒，其可携带多达30kb的外源DNA。此外，腺病毒载体是在细胞核内作为非复制的染色体外DNA，所以不存在插入突变诱发细胞基因型的改变。但缺点也很明显，其一基因表达的持续时间很短，其二具有较强的细胞免疫原性[11]。此外，由于一部分人已经存在抗腺病毒的抗体，这会影响这种病毒的基因转移效率。但是这一问题可以通过选择性衣壳修饰AAV来克服，以逃避先前存在的抗体识别或者直接将AAV注射到组织中，野生型AAV可以以特定位点的方式整合到宿主染色体，它是胰岛细胞基因治疗的合适载体系统。为了验证AAV载体转染胰腺内分泌细胞的有效性，研究人员使用质粒pSub201构建AAV载体，将pSub201质粒中的野生型AAVDNA类似物克隆到pSP72克隆质粒中，用异源启动子代替AAV开放阅读框架，结果表明转化胰岛细胞系INS-1和RINm5F的AAV载体转染效率较高，分别为65%和57%。这些研究结果表明AAV载体是一种将基因传递到胰腺和分离的胰腺β细胞的有效基因载体[12]。

最后，单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)也被用作病毒载体。HSV-1在靶细胞中具有高效转染效率，可感染分裂细胞和非分裂细胞，然而其潜在风险仍有待确定。除了改善已建立的载体系统，还正在开发新的病毒载体用于靶向基因治疗。目前研究最多的是麻疹病毒，这是一种包膜病毒，可以靶向肿瘤细胞以发挥其溶瘤潜能。与逆转录病毒相反，由于麻疹病毒的附着和融合功能是在单独的蛋白质上编码的，因此，更容易操纵结合特异性而不会影响进入细胞的效率[13]。

2.2 非病毒载体

非病毒载体与病毒载体相比虽然安全，但是非病毒载体的基因转移效率不是很高。传统传递遗传物质的非病毒方法包括直接注射DNA、电穿孔和基因枪法[14]。目前已经开发了基于纳米粒、脂质体和多聚体的非病毒载体用于基因疗法核酸的递送，其中阳离子脂质体和聚合物在递送各种类型的核酸方面取得了重大进展。

2.2.1 聚合物载体

合成聚合物载体由于其潜在的安全性和多功能性而对基因递送具有吸引力。然而，聚合载体的基因传递效率较低，所以主要用于运载低浓度下具有生物学作用的治疗基因。聚乙烯亚胺被认为是最有效的阳离子聚合物之一。脂联素是一种具有降血糖和抗动脉粥样硬化作用的蛋白，Park等[15]使用与聚合物载体聚乙烯亚胺复合的微小环状DNA将脂联素基因传递到饮食诱导的肥胖C57BL/6J小鼠中，研究表明在体外和体内，微小环状DNA的表达水平均比常规质粒的脂联素表达水平高。该方法可产生足够的血脂联素水平，并且将与胰岛素抵抗相关的参数标准化，所以聚合物载体介导的脂联素基因疗法可用于治疗2型糖尿病。小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)是一种长度为20～25nt的双链RNA，它可以通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)抑制特定基因的表达。Jeong等[16]在使用聚合物载体聚乙烯亚胺静脉给药后，在使用环磷酰胺诱导的糖尿病动物模型中评估了Fas siRNA对糖尿病发生与发展的影响。Fas siRNA的全身性非病毒递送显示糖尿病发病率显著延迟长达40d，而裸Fas siRNA或磷酸盐缓冲溶液处理的对照小鼠则在20d内患上了糖尿病。在这项研究中，聚乙烯亚胺介导的Fas siRNA递送体系可保护非肥胖糖尿病小鼠免受环磷酰胺诱导的胰岛炎和糖尿病的侵害，证明了基于非病毒载体的siRNA基因疗法在预防1型糖尿病中的潜在用途。

2.2.2 电穿孔

通过体内电穿孔(electroporation,EP)增强非病毒基因的转移，该技术可用于针对胰岛细胞抗原进行DNA疫苗接种，当与适当的免疫配体结合使用时可导致T细胞的生成和对T1DM的保护。体内EP也可用于糖尿病的非免疫治疗，它可用于递送蛋白质药物，例如胰高血糖素样肽1，瘦素或转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)，它们通过恢复葡萄糖稳态，促进胰岛细胞存活与生长并促进伤口愈合和改善其他并发症应用于T1DM和T2DM。Sato等[17]对成年麻醉的雌性小鼠进行胰腺内直接注射含绿色荧光蛋白环状质粒的溶液,使用方脉冲发生器进行电穿孔。基因递送1d后，在注射的胰腺部分观察到绿色荧光蛋白的表达。转染后1周内，绿色荧光蛋白表达水平降低至基线。此研究证明电穿孔对于胰腺细胞的安全和转染是有效的，这种向胰腺转移基因的方法可能会在胰腺疾病的基因治疗和特定基因功能的研究中得到应用。

2.2.3 纳米粒

纳米粒是一系列直径小于100nm的高分子材料。纳米粒具有独特的性质，例如独特的结构、单分散性、高表面质量比、高效传递基因以及蛋白质和小分子化学药物的特性，使其适用于生物医学的各种领域。壳聚糖是一种直链多糖，壳聚糖纳米粒具有良好的生物相容性且无毒性，是一种理想的非病毒载体，可广泛用于基因转移。将质粒包埋在壳聚糖纳米粒中，它可以抵抗核酸酶的降解。此外，它还通过抑制细菌的新陈代谢表现出抗菌活性。研究[18]发现人胰岛素基因可以被壳聚糖DNA纳米粒成功转染并在糖尿病大鼠的胃肠道中有效表达。虎杖苷(polydatin,PD)具有多种药理活性，但其生物利用度仍是关键的问题。Abdel Moneim等[19]开发一种新的口服配方—壳聚糖纳米粒，以提高PD治疗2型糖尿病的潜力；与游离PD相比，这种口服配方—壳聚糖纳米粒在糖尿病大鼠中表现出更明显的抗糖尿病作用。因此，纳米粒作为治疗糖尿病的非病毒载体有极大的应用前景。

3 相关靶基因和靶点的鉴定

3.1 相关靶点的鉴定

1型糖尿病的本质是胰腺β细胞被自身免疫破坏导致患者终生对胰岛素产生依赖。但每天多次注射或持续皮下注射胰岛素不仅繁琐还会引起低血糖，甚至可能危及生命。虽然近年来胰岛素治疗更精准有效，但仅靠胰岛素治疗无法预防肾病、视网膜病变以及血管和心脏病，这些并发症仍然发生在大量糖尿病患者中。长期以来，人们一直在寻求糖尿病的根本治愈疗法，包括胰岛移植、全胰腺移植、β细胞再生和胰岛素基因治疗。然而，目前还没有令人满意的方法来治愈这种疾病。

3.1.1 胰腺β细胞

胰腺中含有三种主要的细胞类型α、β和δ。在1型糖尿病中，分泌胰岛素的β细胞被炎症细胞破坏，所以治疗1型糖尿病的基因治疗方案以β细胞为最佳靶点。胰岛素基因治疗的本质是遗传物质转移到特定靶细胞。虽然胰岛素基因治疗会受到胰岛素生理机制的阻碍，但是胰腺β细胞具有特定的肽酶、葡萄糖传感系统和分泌颗粒，其可以通过胞吐迅速释放胰岛素来调节机体血糖水平，而在胰腺β细胞外重建这一调节系统是非常不容易的。

3.1.2 肝细胞

肝细胞是基因治疗产生胰岛素的另一个可能靶点。肝细胞的主要优点是它们有一个类似于胰腺β细胞的葡萄糖传感系统。但肝细胞用于基因治疗的缺点是它们不含有胰岛素前处理酶或分泌颗粒，其中未加工的胰岛素可以在生理刺激下通过胞吐迅速释放。在葡萄糖诱导型启动子下，含有胰岛素基因的重组腺病毒载体被用来转运肝细胞，可纠正STZ诱导的糖尿病大鼠高血糖。研究发现[20]，将胰岛素靶向肝脏可纠正由外周胰岛素输送引起的葡萄糖代谢障碍。Lee等[21]对STZ诱导的糖尿病大鼠肝脏门静脉注射改良型胰岛素基因，发现大鼠可以恢复到正常血糖水平。

3.1.3 K细胞

胃肠道中有大量的内分泌细胞，其中胃肠道K细胞也是糖尿病基因治疗中潜在且理想的靶细胞。K细胞可以分泌葡萄糖依赖型促胰岛素多肽(glucose-dependent insulinotropic ploypeptide,GIP)，其可刺激β细胞释放胰岛素并促进β细胞的再生。研究表明在胃肠道K细胞中，在GIP基因5′调控区的控制下，克隆的人胰岛素基因可以产生生物活性胰岛素，并在STZ诱导后保护小鼠免受糖尿病的影响[22]。Mojibian等[23]发现通过转基因技术使肠道K细胞产生胰岛素，可以保护非肥胖糖尿病小鼠免于自身免疫性糖尿病。综上所述，开发一种有效的靶向基因传递方法对体内基因治疗具有重要意义。

3.2 相关靶基因

3.2.1 非编码小RNA分子

非编码小RNA分子(microRNA，miRNA)可以减轻或预防各种疾病发展，所以其成为各种疾病治疗的靶点，在临床上具有广泛的应用前景。人类中有两千多个miRNA，且每个miRNA不止调控一个基因。miRNA在胰腺功能中也起着重要作用。miR-375可以通过调节肌营养蛋白和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1的表达，从而调节胰岛素分泌[24]。Wang等[25]发现miRNA-92a可以通过靶向转录因子KLF2，进而抑制高糖环境下诱导的细胞凋亡，并促进胰岛素的分泌和增殖。所以miRNA-92a可以作为糖尿病临床治疗的潜在靶标，基于miRNA的治疗策略具有巨大的临床应用前景。

3.2.2 蛋白激酶

蛋白激酶CK2是细胞内表达的一种丝氨酸和酪氨酸激酶。一方面CK2可以降低β细胞胰岛素的释放，从而影响胰岛素分泌水平；另一方面，这种激酶促进脂肪细胞增生肥大以及视网膜的血管化[26]。因此，CK2抑制剂可能通过改善胰岛素分泌来治疗T2DM。研究发现CK2抑制剂抑制脂肪组织的增生，从而减轻肥胖引起的糖尿病。此外，用CK2抑制剂或大黄素对小鼠进行预处理，可抑制缺氧诱导视网膜病变模型小鼠的视网膜新生血管生成。因此，抑制CK2可能是抑制糖尿病诱导的视网膜组织新生血管生成的一种合适的治疗策略。抑制CK2活性降低了糖尿病视网膜内皮细胞的增殖、迁移以及细胞活力[27]。但是目前可用的CK2抑制剂具有较高的细胞膜穿透能力，没有细胞特异性。因此，开发细胞特异性CK2抑制剂靶向细胞是目前亟待解决的问题。

3.2.3 胰十二指肠同源盒1转录因子

胰十二指肠同源盒1转录因子(pancreatic and duodenal homeobox-1,PDX-1)可以调节胰岛素和胰高血糖素的分泌，研究[28-29]发现，PDX-1基因的突变会导致幼年糖尿病和其他胰腺疾病。PDX-1对重塑β细胞活性的治疗作用已经被报道出来，在2型糖尿病动物模型中，PDX-1基因过表达可以提高β细胞的质量和糖耐受。Amatya等[30]构建了一种含人PDX-1的融合蛋白，研究其在非肥胖糖尿病体内和体外抗T1DM的治疗潜力。结果与预期一致，构建的融合蛋白起到了治疗糖尿病的作用。其中PDX-1部分促进了胰岛β细胞的分化和新生，进而产生功能性的胰岛素。综上所述，PDX-1作为一种抗T1DM药物可以起到治疗自身免疫性糖尿病的作用。

4 基因靶向递送系统的选择

尽管基因治疗在临床前研究取得了显著的成果，但其实际临床应用仍然有限，如何运用一种更加安全有效的途径将靶向基因精准递送到相应组织是目前亟待解决的问题[31]。要成功实现基因的靶向治疗，必须将基因精准传递到靶细胞并在靶细胞中表达，并且不损害非靶细胞。其中一种方法是使用仅在靶细胞中激活的启动子，虽然这一策略可以减少甚至消除转基因的副作用，但它并不能解决那些由载体颗粒错误定位所引起的不良反应。因此，单靠转录水平的靶向作用不足以确保靶细胞中的基因表达，所以需要有效的基因靶向递送系统。目前应用比较广泛的有纳米颗粒药物靶向递送系统，多糖靶向递送系统，超声靶向微泡破坏技术等联合应用[32]。

4.1 纳米粒药物靶向递送系统

当对纳米粒表面进行修饰后，纳米粒就可以主动定位到特定的靶向部位，并具有通过血脑屏障进入中枢神经系统的能力。当维生素B12、叶酸、转铁蛋白等这些靶向配体在对纳米粒进行修饰后，促进了机体对胰岛素的摄取。另外，它可检测体内RNA动态变化，应用范围较广，同时也提高了基因靶向治疗糖尿病在临床的功能和实用性。药物递送纳米粒中包含金属纳米粒，金属氧化物纳粒和非金属纳米粒。但由于其毒性，特别是由纳米粒触发神经元引起的神经毒性是靶向药物输送中的严峻挑战。其中纳米粒的大小、形状和表面电荷都对基因的传递有一定影响，所以评估药物纳米粒的神经毒性对将来开发新的针对人体安全性的药物靶向传递系统具有重大意义[33]。Olojede等[34]发现高效抗逆转录病毒疗法共轭银纳米颗粒改善2型糖尿病大鼠睾丸损伤。对纳米药物的研发，尤其是针对糖尿病这类难治性疾病具有一定意义，也对未来纳米粒药物递送系统应用于临床糖尿病基因靶向治疗有较大的参考价值。

4.2 多糖靶向递送系统

在药物递送系统中使用多糖作为靶向载体是近几年的热门研究，特别是那些具有免疫细胞特异性识别能力的多糖，使其能够用于靶向递送系统[35]。β-D-葡聚糖是天然存在的具有免疫调节活性且不易分解的多糖，目前已引起人们广泛的关注。β-D-葡聚糖可以通过氢键以疏水相互作用的形式与同型寡聚脱氧核苷酸结合并形成新型复合物。C型凝集素受体1(dectin-1)是参与识别的主要受体并在抗原呈递细胞中表达[36]。当其用于免疫治疗时，能够被巨噬细胞等免疫细胞特异性识别。所以β-D-葡聚糖可被开发为具有稳定生物相容性和特异性的靶向递送载体并有望在靶向糖尿病基因治疗方面得到应用。

4.3 超声靶向微泡破坏技术

超声靶向微泡破坏技术(ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)是一种很有前景的基因靶向递送策略，其是将pDNA掺入脂质壳中，然后由包裹全氟化碳气体的脂质壳组成的微泡注入体内循环系统。在超声照射下，微泡破裂并在周围细胞的膜中产生瞬时孔，此时pDNA被插入靶细胞中。UTMD具有许多基因治疗所需的特性，包括低毒性、低免疫原性、重复使用的潜力以及器官的特异性。人血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因传递到移植的胰岛和周围的组织会促进胰岛血运重建，并改善机体血糖，说明UTMD介导的基因传递可安全有效地改善胰岛移植后血运重建[37]。Zhao等[38]利用纳米粒载体与UTMD结合的疗法首次成功将碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)递送至糖尿病大鼠的心脏。此研究证实将非病毒载体与UTMD技术相结合是将bFGF靶向递送至心脏的有效策略，并且这种生长因子疗法可以通过恢复心脏功能以及受损结构来逆转糖尿病性心肌病进程。这项技术使用超声波能量将基因特异性转移到胰腺中并且无需利用病毒载体，给临床上基因靶向治疗提供了新方法。

5 小结与展望

综上所述，基因靶向治疗正逐渐应用于不同领域的发展。与药物治疗相比，基因靶向治疗是一种靶向性生物治疗手段，其治疗效果作用持久并且靶向性强，具有更广泛的应用前景。而未来的研究更需要着眼于克服基因靶向传递系统的准确性和安全性，才能更好应用于临床糖尿病的治疗。从靶基因到靶点的鉴定再到载体的选择对基因靶向治疗的疗效有较大影响，而制备具有高效靶向定位能力的药物递送载体系统更是基因靶向治疗的关键。目前虽然在糖尿病肾病领域已经有了一定的突破进展，但是基因靶向治疗糖尿病的实质性应用仍充满了挑战。尽管如此，这一技术的出现与发展给难治性疾病的临床治疗提供了全新的治疗思路和方法，未来有望在临床上实现大规模应用，推动人类疾病的治疗进程，尤其是为糖尿病患者带来福音。