二甲双胍对过氧化氢所致脑片损伤的作用研究*

蔡雪洲，丁未尧，谢　航，徐华荣，蔡　飞，李彩蓉

(1.湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院临床医学院)



二甲双胍对过氧化氢所致脑片损伤的作用研究*

蔡雪洲1，丁未尧1，谢航1，徐华荣1，蔡飞1，李彩蓉2**

(1.湖北科技学院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院临床医学院)

摘要：目的 探讨二甲双胍对过氧化氢(H2O2)所致脑片损伤的保护作用。方法 通过H2O2孵育制备小鼠脑片损伤模型，预先给予不同浓度的二甲双胍进行干预。观察小鼠脑片TTC染色情况，测定TTC染色产物formazan的含量及脑片LDH的释放率。结果 H2O2可导致脑片TTC染色变浅、formazan含量减少及LDH含量增加，预先给予二甲双胍可剂量依耐性的增加脑片染色、增加formazan含量及减少LDH含量。结论 二甲双胍对H2O2所致的脑片损伤有一定的保护作用。

关键词：脑片；过氧化氢；二甲双胍；TTC

糖尿病是一种以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，过量的氧自由基是糖尿病及其并发症损伤组织器官最重要的因素之一。氧自由基不但可以直接损伤细胞，导致细胞坏死，它还可以通过介导线粒体途径及转录因子等间接导致细胞凋亡。过氧化氢(H2O2)为强的氧化剂，作用于机体使机体氧自由基代谢失衡导致损伤。脑片介于整体和细胞之间，既保持了神经元与其他神经元、胶质细胞的相互关系，又排除了体温、pH值、离子浓度变化等因素干扰，可在严格控制的条件下观察[1，2]，故建立离体脑片H2O2损伤模型可为新型定量分析提供基础。

二甲双胍为双胍类口服降血糖药，具有确切的抗氧化作用[3]，有体外研究证实二甲双胍可剂量依赖性与羟自由基发生反应[4]。本文旨在通过H2O2脑片损伤模型探讨二甲双胍对氧化损伤的保护作用，为二甲双胍在糖尿病脑组织损伤的防治方面提供实验依据。

1材料与方法

1.1实验动物动物：雄性昆明种小鼠，体重20～25g，由湖北省实验动物研究中心提供，动物许可证号SCXK(鄂)2015-0018。

1.2主要试剂30%过氧化氢(分析纯，广东西陇化工厂)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC，分析纯，国药集团化学试剂有限公司)用0.2mol/L的磷酸缓冲液(pH7.4)配制成1%的溶液，避光保存。人工脑脊液(ACSF)的配制(pH=7.4)(所用试剂均为分析纯)：NaCl，7.247g/L;KCl，0.224g/L;NaHCO3，2.184g/L;NaH2PO4·2H2O，0.193g/L;MgSO4·7H2O，0.493g/L;CaCl2，0.222g/L;C6H12O6·H2O，1.982g/L。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)试剂检测盒购自南京建成生物制品有限公司。

1.3全脑脑片及过氧化氢模型的制备称取小鼠体重后颈椎脱臼处死，迅速断头，取出全脑，弃去小脑，立即固定在切片台上浸入预先冻成冰水混合液的通有混合气体(95%O2+5%CO2)的人工脑脊液中，分别用振动切片机沿纵轴切成600 μm的脑片(通常可切5～6片)，保持脑片孵育时不重叠。分别置于不同条件下于28℃孵育，在孵育的过程中持续通入混合气体，调节气流量，避免脑片受到气流的冲击，孵育过程中避免脑片的重叠、挤压等影响脑片的活性。孵育完毕，一部分脑片用于TTC染色，另一部分脑片保存于-80℃用于生化指标的测定。

实验分组：分为四组，每组8只小鼠，分别切成脑片。正常组在人工脑脊液中孵育90min；模型组在人工脑脊液中孵育30min后，转为含2mmol/L H2O2的人工脑脊液中孵育60min；低剂量组在含25mmol/L二甲双胍的人工脑脊液中孵育30min后转为含2mmol/L H2O2的人工脑脊液中孵育60min；高剂量组在含50mmol/L二甲双胍的人工脑脊液中孵育30min后转为含2mmol/L H2O2的人工脑脊液中孵育60min。

1.4TTC染色及染色产物的测定将四组脑片转至24孔板中，加入3ml的1%TTC溶液于37℃下避光显色30min，取出后将同一组脑片取出后平铺于玻璃板上拍照观察。

拍照后用滤纸吸去表面水分，称取湿重，以每克脑片20ml的比例加入提取液(乙醇∶二甲基亚砜=1∶1)，避光在37℃水浴摇1h，密闭容器避光放置24h，按每孔200uL加入对应的提取后的溶液于酶标板中，酶标仪测定各孔在490nm处吸光度值(A490)。

1.5LDH的测定将冻存于EP管中脑片解冻，称重，按1∶9的比例加入生理盐水，在50Hz冷冻条件下匀浆5min，然后用冷冻离心机12000rpm离心15min，取上清液，即10%的脑组织匀浆液。用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，蛋白匀浆液稀释至0.02%后参照LDH试剂盒说明书，测定脑片LDH的活性(组织中LDH活性=(测定OD值-对照OD值)/(标准OD值-空白OD值)*标准品浓度/蛋白浓度)。

2结果

2.1二甲双胍对H2O2所致脑片损伤TTC染色的影响TTC可被活细胞中的具有还原性的酶还原生成粉红色的甲臜(formazan)，脑片活性越大则formazan含量越高，颜色越深，A490值越大。与正常组相比，模型组损伤严重。而预先加入25mmol/L二甲双胍的低剂量组和加入50mmol/L二甲双胍的高剂量组都有明显的改善，且高剂量组的作用较低剂量组的作用要强，则表明二甲双胍对H2O2的损伤有一定的保护作用(图1)(封二)。

2.2二甲双胍对H2O2所致脑片损伤TTC染色产物的影响 取TTC染色后的脑片于乙醇和二甲基亚砜的混合液洗脱后，在490nm处测定吸光度A490。正常组的A490平均值最高(3.668)，与模型组(2.298)相比，低剂量组(2.753)和高剂量组(3.152)A490依次增加(图2)。

图2　二甲双胍对H2O2所致脑片损伤TTC染色产物的影响

2.3二甲双胍对H2O2所致脑片损伤LDH的影响实验结果可见，与模型组相比，低剂量组和高剂量组LDH释放量依次降低，总抗氧化能力增加(图3)。

图3　二甲双胍对H2O2所致脑片损伤LDH的影响

3讨论

糖尿病可导致多种器官损伤，糖尿病慢性并发症遍及全身，是其致死致残的主要原因。糖尿病可导致糖尿病肾病、心肌病、周围神经病变、视网膜病变及中枢神经系统病变。既往研究表明，糖尿病中枢神经系统病变特别是认知损伤的可能发病机制与脑血管病变、氧化应激(如H2O2)、糖基化终末产物增多、神经生长因子缺乏、细胞存活信息传导通路的障碍、神经细胞凋亡等有关。但有关糖尿病认知障碍的具体发病机制尚不清楚，需做进一步的研究。

二甲双胍源于植物法国丁香的提取物，是2型糖尿病一线治疗药物，广泛应用于临床。二甲双胍的降糖作用主要是通过减少肝脏葡萄糖产生以及增强胰岛素刺激下的外周组织对葡萄糖的摄取，减少小肠葡萄糖的吸收。二甲双胍除了能够降低血糖，改善胰岛素抵抗之外，还具有心血管保护作用。但对糖尿病中枢神经系统的作用尚未见报道。

脑片因模拟在体脑环境及避免机体因素的作用，对于脑功能的研究越来越广泛。TTC染色、TTC染色产物formazan测定及一些生化指标检测多用于脑片过氧化氢损伤模型实验中用于检测脑损伤及其恢复情况[5～7]。LDH作为细胞内标志酶，是糖的无氧酵解和糖异生的重要酶系之一。当神经元受损、膜通透性改变时，LDH漏出量明显增加，是反映神经细胞损伤的可靠生化指标[8，9]。

本实验结果表明，二甲双胍(25mmol/L和50mmol/L)可对抗H2O2引起小鼠脑片的损伤，二甲双胍可能通过减轻H2O2致小鼠脑片的氧化应激损伤，增强机体的抗氧化能力，从而延缓氧自由基所致的神经细胞损伤和死亡。有文献报道二甲双胍的“氧化有益”假说，二甲双胍能促进转录因子Nrf2的合成，Nrf2是抗氧化系统的总司令，是各类抗氧化酶的控制枢纽，故二甲双胍的对中枢神经系统氧化损伤的保护作用还有待进一步的研究。

参考文献：

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[2]Zhan RZ，Qi S，Wu C，et al.Intravenous anesthetics differentially reduce neurotransmission damage caused by oxygen-glucose deprivation in rat hippocampal slices in correlation with N-methyl-D-aspartate receptor inhibition[J].Critical Care Medicine，2001,29(4):808

[3]Alessandra G，Giulio C，Paolo P，et al.Metformin prevents glucose-induced protein kinase C-beta2 activation in human umbilical vein endothelial cells through an antioxidant mechanism[J].Diabetes，2005,54(4):1123

[4]Khouri H，Collin F，Bonnefont-Rousselot D，et al.Radical-induced oxidation of metformin[J].European Journal of Biochemistry，2005，271(23-24):4745

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[8]Egea J，Rosa AO，Sobrado M，et al.Neuroprotection afforded by nicotine against oxygen and glucose deprivation in hippocampal slices is lost in alpha7 nicotinic receptor knockout mice[J].Neuroscience，2007,145(3):866

[9]Scopel D，Fochesatto C，Cimarosti H，et al.Exercise intensity influences cell injury in rat hippocampal slices exposed to oxygen and glucose deprivation[J].Brain Research Bulletin，2006,71(s1-3):155

Protective Effect of Metformin on Brain Slice Injury Induced by Hydrogen Peroxide in Mice

CAI Xue-zhou，DING Wei-yao，LI Cai-rong,et al

(HubeiUniversityofScienceandTechnology,XianningHubei437100,China)

ABSTRACT：Objective To observe the protective effect of metformin on brain slice injury induced by hydrogen peroxide in mice. Methods The brain slice injury model was induced by incubation with hydrogen peroxide and was treated with different concentrations of metformin.TTC staining，the contents of formazan and LDH were tested to assess the brain slice injury.Results Hydrogen peroxidereduced the color of TTC staining and the content of formazan，increased the content of LDH.Administration of metformin dose-dependently increased the color of TTC staining and the content of formazan，decreased the content of LDH.Conclusion Metformin has protective effect on brain slice injury induced by hydrogen peroxide.

KEY WORDS：Brain Slice;Hydrogen peroxide；Metformin;TTC

(收稿日期：2015-12-16)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.02.096

中图分类号：R-332

文献标识码：A

文章编号：2095-4646(2016)02-096-03

基金项目：国家自然科学基金(81470049)；湖北省大学生创新创业项目(1503)

**通讯作者，E-mail:xnlcr@163.com