姜黄素对人骨肉瘤U-2OS细胞细胞周期、凋亡及Bcl-2表达的影响

黄　牛

(武汉大学基础医学院生物医学工程学，湖北 武汉 430071)



姜黄素对人骨肉瘤U-2OS细胞细胞周期、凋亡及Bcl-2表达的影响

黄牛

(武汉大学基础医学院生物医学工程学，湖北 武汉 430071)

摘要：目的 探讨姜黄素对人骨肉瘤U-2OS细胞细胞周期、凋亡及Bcl-2表达的影响。方法 采用不同浓度(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)、不同时间(24h、48h、72h)姜黄素处理人骨肉瘤U-2OS细胞，分别采用MTT法、流式细胞仪及western blot检测细胞增殖、细胞凋亡及Bcl-2蛋白表达。结果 姜黄素对U-2OS细胞体外增殖具有显著的抑制作用，并呈现剂量及时间依赖性。随着姜黄素浓度及作用时间的增加，G0-G1期细胞所占比率显著增高。姜黄素对U-2OS细胞凋亡具有显著的促进作用，并呈现剂量及时间依赖性。姜黄素处理后U-2OS细胞Bcl-2蛋白表达显著降低，且其降低程度与姜黄素浓度呈正相关。结论 姜黄素可通过剂量依赖与时间依赖，促进骨肉瘤U-2OS细胞G0-G1期阻滞，从而诱导骨肉瘤U-2OS细胞凋亡，调节凋亡相关基因Bcl-2低表达是其可能作用机制。

关键词：姜黄素；骨肉瘤；凋亡；细胞周期；Bcl-2

骨肉瘤是临床常见的恶性骨肿瘤之一，好发于青少年，其对放、化疗等治疗方案敏感性较低，预后较差。因此，探讨更有效的骨肉瘤防治措施是近年来临床研究的热点难点。姜黄素是由姜科黄属植物姜黄根茎中提取的多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤等多种生物学活性[1]。近年来研究表明，姜黄素可诱导多种体外培养的肿瘤细胞如胃癌[2]、肝癌[3]及结肠癌[4]等的凋亡，但其对人骨肉瘤的作用鲜见报道。为探讨姜黄素对人骨肉瘤细胞的作用，本研究采用体外培养方法，观察不同浓度、不同时间姜黄素处理对人骨肉瘤U-2OS细胞凋亡、细胞周期及Bcl-2表达的影响，旨在为骨肉瘤的临床治疗提供可靠理论依据。

1材料与方法

1.1材料姜黄素、MTT(Sigma公司)；人骨肉瘤U-2OS细胞株(ATCC细胞库，美国)；胎牛血清、DEME培养基、PBS缓冲液、胰蛋白酶(Gibco公司)；Annexin-V-FITC凋亡试剂盒(Beckman coulter公司)；Bcl-2兔抗人多克隆抗体(Santa Cruz公司)。

1.2细胞培养复苏人骨肉瘤U-2OS细胞株，PBS洗涤3次，DMEM培养基洗涤3次，用含有10%胎牛血清、0.1g/L链霉素、105U/L青霉素DMEM培养液将细胞混匀，37℃、5% CO2培养箱中培养，每天换液1次。收集对数生长期细胞，采用不同浓度姜黄素(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)和不同时间(24h、48h、72h)对人骨肉瘤U-2OS细胞进行处理。

1.3姜黄素对U-2OS细胞体外增殖抑制作用胰酶消化人骨肉瘤U-2OS细胞，PBS缓冲液洗涤3次，800rmp 离心10min，弃上清，DMEM培养基调整细胞浓度为2×105个/ml，将细胞加至96孔培养板，200μl/孔。将细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养2h，加入姜黄素，终浓度分别为0μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml，每孔设3个复孔，共5组。细胞置于37℃、5% CO2培养箱中分别培养24h、48h、72h，培养结束时，加入MTT(5mg/ml)20μl/孔，37℃、5% CO2培养箱4h，800rmp离心10min，弃上清，加入酸化异丙醇180μl/孔，震荡使紫色结晶溶解，酶标仪测OD570nm吸光值。

1.4姜黄素处理后U-2OS细胞形态变化倒置显微镜下观察不同浓度姜黄素处理72h后U-2OS细胞形态变化。

1.5细胞凋亡率及细胞周期检测采用同“方法1.3”相同方法培养细胞，培养结束后，800rmp 离心10min，弃上清，流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.6Bcl-2蛋白表达检测采用westernblot检测Bcl-2蛋白表达。收集不同浓度姜黄素培养72h后的U-2OS细胞，提取其胞质蛋白，行SDS-PAGE电泳，转至硝酸纤维膜，5%封闭液4℃封闭4h，TBS缓冲液漂洗3次，加入Bcl-2兔抗人多克隆抗体(1∶1000)，4℃孵育过夜，TBS缓冲液漂洗3次，加入相应二抗(1∶500)，室温孵育2h，增强化学发光显色系统显色。

2结果

2.1姜黄素对U-2OS细胞体外增殖抑制作用姜黄素对U-2OS细胞体外增殖具有显著的抑制作用。在同一时间条件下，姜黄素浓度越高则U-2OS细胞增殖抑制作用越明显(P<0.05)；在同一浓度条件下，姜黄素处理时间越长则U-2OS细胞增殖抑制作用越明显(P<0.05)。提示姜黄素对U-2OS细胞体外增殖抑制作用呈现显著的剂量依赖性和时间依赖性，见表1。

表1　不同浓度姜黄素对U-2OS细胞体外增殖抑制作用±s，n=3)

与对照组比较，*P<0.05；与24h组比较，#P<0.05

2.2姜黄素处理后U-2OS细胞形态变化倒置显微镜下可见未经姜黄素处理的U-2OS细胞状态良好，折光性佳，排列紧密。随着姜黄素处理浓度的增大，U-2OS细胞数量逐渐减少，折光性差，排列疏松，附壁性减弱，且有部位细胞形态变为圆形，偶见凋亡细胞碎片。

2.3姜黄素对U-2OS细胞周期的影响在同一时间条件下，姜黄素浓度越高则U-2OS细胞G0-G1期细胞所占比率越高，S期、G2期细胞所占比率越低(P<0.05)；在同一浓度条件下，姜黄素处理时间越长则G0-G1期细胞所占比率越高，S期、G2期细胞所占比率越低(P<0.05)。提示姜黄素可使U-2OS细胞停滞于G0-G1期，从而抑制U-2OS细胞体外增殖，并呈现显著的剂量依赖性和时间依赖性，见表2。

表2　不同浓度姜黄素对U-2OS细胞周期的影响±s，n=3)

与对照组比较，*P<0.05;与24h组比较，#P<0.05

2.4姜黄素对U-2OS细胞凋亡的影响姜黄素对U-2OS细胞凋亡具有显著的促进作用。在同一时间条件下，姜黄素浓度越高则U-2OS细胞凋亡率越高(P<0.05)；在同一浓度条件下，姜黄素处理时间越长则U-2OS细胞凋亡率越高(P<0.05)。提示姜黄素对U-2OS细胞凋亡促进作用呈现显著的剂量依赖性和时间依赖性，见表3。

表3　不同浓度姜黄素对U-2OS细胞凋亡率的影响±s，n=3)

与对照组比较，*P<0.05;与24h组比较，#P<0.05

2.5姜黄素对U-2OS细胞Bcl-2蛋白表达的影响姜黄素处理72h后U-2OS细胞Bcl-2蛋白表达显著降低，且其降低程度与姜黄素浓度呈正相关，见图1。

图1　姜黄素处理后U-2OS细胞Bcl-2蛋白表达

3结论

细胞凋亡是指细胞为维持机体内环境稳定，在基因控制下进行的有序性、自主性死亡。与细胞坏死的被动过程不同，细胞凋亡是一个主动过程，并与一系列基因的激活、表达及调控密切相关[5]。Bcl-2基因家族包括抑制细胞凋亡基因如Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W及促进细胞凋亡的基因如Bax、Bcl-Xs等，该家族在调控细胞凋亡过程中具有十分重要的作用。既往研究证实[6]，Bax过表达可显著促进细胞凋亡，但抑制Bcl-2等抑制细胞凋亡基因的过表达可起到促进Bax引起的细胞凋亡的作用。

姜黄素作为多效性天然活性物质，不仅可保护机体正常细胞免受损伤，也可通过多途径抑制肿瘤细胞增殖。肖扬等[7]以阿霉素为诱导药物，采用阿霉素大剂量冲击法建立人骨肉瘤U-2OS细胞耐药模型(U-2OS/ADM)，并在此基础上探讨姜黄素对细胞多药耐药性的细胞作用，结果显示姜黄素可有效增加阿霉素对U-2OS/ADM的细胞毒作用，从而逆转U-2OS/ADM细胞的多药耐药现象。范全等[8]采用姜黄素处理人骨肉瘤U2OS细胞，可显著抑制细胞体外增殖并诱导细胞凋亡，且其作用呈剂量依赖性，与本研究结果一致。恶性肿瘤的发生与发展和肿瘤细胞的增殖与凋亡密切相关，细胞凋亡具有负向调节作用，从而有效抑制肿瘤生长[9]。因此，如何诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的新方向。磷脂酰丝氨酸(PS)作为凋亡细胞表面分子充分暴露于凋亡细胞膜外，因此采用PS结合Annexin对细胞凋亡进行检测是目前最理想的细胞凋亡定量检测方法。流式细胞仪PI染色法结果显示，姜黄素可显著促进U-2OS细胞凋亡，并呈现显著的剂量依赖性和时间依赖性，且大多数细胞阻止于G0-G1期，这可能与姜黄素对DNA合成的抑制作用有关。采用westernblot检测Bcl-2蛋白表达，结果显示经姜黄素(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)作用72h后，U-2OS细胞中Bcl-2蛋白表达随姜黄素浓度增加而显著降低，提示姜黄素降低Bcl-2蛋白表达是其促进U-2OS细胞凋亡的可能作用机制之一。

本研究结果显示姜黄素对人骨肉瘤U-2OS细胞的作用呈现明显的时间和浓度依赖性，所以随浓度升高，作用越强。若今后在临床应用过程中，姜黄素可能会对人体其他正常细胞产生一系列作用，再研究其最佳浓度。姜黄素作为潜在的治疗骨肉瘤(尤其是对化疗药物多药耐药性骨肉瘤)的化疗药物，其作用机制需进一步深入研究。

参考文献：

[1]Dhule SS,Penfornis P,He J,et al.The combined effect of encapsulating curcumin and C6 ceramide in liposomal nanoparticles against osteosarcoma[J].Mol Pharm,2014,11(2):417

[2]Cai XZ,Huang WY,Qiao Y,et al.Inhibitory effects of curcumin on gastric cancer cells:a proteomic study of molecular targets[J].Phytomedicine,2013,20(6):495

[3]Darvesh AS,Aggarwal BB,Bishayee A.Curcumin and liver cancer: a review[J].Curr Pharm Biotechnol,2012,13(1):218

[4]Gou ML，Men K，Shi HS，et al.Curcumin-loaded biodegradable polymeric micelles for colon cancer therapy in vitro and in vivo[J].Nanoscale,2011,3(4):1558

[5]Wu X，Cai ZD，Lou LM，et al.Expressions of p53，c-MYC，BCL-2 and apoptotic index in human osteosarcoma and their correlations with prognosis of patients[J].Cancer Epidemiol,2012,36(2):212

[6]Liang CZ,Zhang JK,Shi Z,et al.Matrine induces caspase-dependent apoptosis in human osteosarcoma cells in vitro and in vivo through the upregulation of Bax and Fas/FasL and downregulation of Bcl-2[J].Cancer Chemother Pharmacol,2012,69(2):317

[7]肖扬,王万春.姜黄素对人骨肉瘤细胞株/阿霉素多药耐药逆转作用的实验研究[J].卫生研究,2011,40(1):103

[8]范全，原向伟，马俊辉.姜黄素诱导人骨肉瘤U2OS细胞凋亡的实验研究[J].华中科技大学学报(医学版),2008,37(4):538

[9]Lin YT,Huang AC,Kuo CL,et al.Induction of cell cycle arrest and apoptosis in human osteosarcoma U-2 OS cells by Solanum lyratum extracts[J].Nutr Cancer,2013,65(3):469

Effect of Curcumin on Cell Cycle，Apoptosis and Bcl-2 Expression in Human Osteosarcoma U-2OS Cells

HUANG Niu

(DepartmentofbasicMedicalSciences，WuhanUniversity，WuhanHubei430071，China)

ABSTRACT：Objective To evaluate the effect of curcumin on cell cycle，apoptosis and Bcl-2 expression in human osteosarcoma U-2OS cells. Methods U-2OS cells were treated with different time(24h，48h or 72h)and different concentrations(10μg/ml，50μg/ml，100μg/ml or 200μg/ml)of curcumin.The cell proliferation，apoptosis and the Bcl-2 protein expressionwere determined by MTT method，flow cytometry and western blot，respectively.Results A time-dependent and dose-dependent growth inhibition of U-2OS cells was shown after exposure to curcumin.With the increase of curcumin concentration and action time，proportion of G0-G1 phase cells was increased significantly，，the Bcl-2 protein expression was obviously reduced，and was positively correlated with the concentration of curcumin.Conclusion Curcumin can induce apoptosis of human osteosarcoma U-2OS cells through the initiation of G0-G1 phase arrest and inhibiting mitosis in dose-dependent and time-dependent manner.Down-regulation of Bcl-2 gene may be the mechanism of apoptosis.

KEY WORDS：Curcumin；Osteosarcoma；Apoptosis；Cell cycle;Bcl-2

(收稿日期：2016-01-03)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.02.099

中图分类号：R285.5

文献标识码：A

文章编号：2095-4646(2016)02-099-04