金线莲苷对人肝癌HepG2细胞增殖、迁移和侵袭的影响*

吕建国，张 晗，周荟慧，余 祎，汤秘密，方国平，吴 喆，孙燕玲**

(1.湖北科技学院医学部国家级全科医学实验教学示范中心，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院医学部药学院；3.湖北科技学院医学部基础医学院)

全球癌症统计报告表明[1-2]，2020年原发性肝癌新发病例约为90.6万，而我国的肝癌病例约占全球病例的一半。肝细胞癌是原发性肝癌的主要类型，占原发性肝癌的75%～85%，通常起病隐匿，病程进展快，预后较差，病死率高[3]。目前，中医药已应用于原发性肝癌各阶段的治疗，其对肝癌的作用主要为拮抗肿瘤血管生成、诱导肿瘤细胞凋亡、提高机体免疫力、降低放化疗的不良反应等[4-5]。金线莲苷是从开唇兰属植物金线莲中提取到的有效活性成分，文献报道[6]，金线莲苷具有降血糖和治疗糖尿病、降血脂和减肥、保肝护肝、保护内皮细胞等药理活性。因此，本研究选取不同浓度金线莲苷作用于人肝癌HepG2细胞，旨在揭示金线莲苷对HepG2细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

人肝癌HepG2细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.1.2 仪器和试剂

仪器：HERAcell 150i型美国Thermo ScientificCO2细胞培养箱；MDF-U53V型日本Sanyo-80℃超低温冰箱；3K15型德国Sigma高速冷冻离心机；Epoc型美国Biotek全波长酶标仪；DMIL LED型德国Leica普通光学显微镜。

试剂：金线莲苷购自上海源叶生物科技有限公司；高糖DMEM培养基、普通级胎牛血清购自美国Gibco公司；MTT试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；CCK-8检测试剂盒购自日本同仁化学研究所；Transwell板购自美国Coming公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

HepG2细胞在5%CO2，37℃条件下用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行常规培养。当细胞融合度达到70%～80%时，用0.25%胰酶消化，制备成单细胞悬液。

1.2.2 四唑盐比色法(MTT)

收集对数生长期的HepG2细胞，以每孔5000个细胞接种于96孔板，细胞贴壁后分别加入不同浓度的金线莲苷，使金线莲苷最终浓度分别为0、5、10、20、40、80μmol/L，每组设3个复孔；继续孵育48h后加入5mg/mL的MTT溶液20μL，4h后终止培养，每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min。在酶标仪490nm处测定各孔的吸光度，计算细胞增殖抑制率。增殖抑制率=(1-实验孔OD值/对照孔OD值)×100%。

1.2.3 细胞增殖-毒性实验(CCK-8)

分别用0、5、10、20、40、80μmol/L金线莲苷对贴壁后的HepG2细胞进行处理，每组3个复孔，继续培养48h，每孔加入10μL CCK-8溶液，孵育1.5h，用酶标仪测定450nm波长处的吸光度(OD)，计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(实验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

1.2.4 Transwell实验

取对数生长期且已饥饿处理12h的HepG2细胞，用无血清培养基制备成单细胞悬液，以每孔5×104个细胞接种于Transwell上室，分别加入不同浓度的金线莲苷，使金线莲苷最终浓度分别为0、5、10、20、40、80μmol/L；将Transwell上室放入24孔板下室，下室每孔加入含10%胎牛血清的培养基，细胞迁移和侵袭实验的每组设3个复孔。在细胞侵袭实验中，预先在Transwell上室的底部均匀铺入Matrigel。继续培养18h，弃去培养基后用棉签轻轻擦拭上室内部，4%多聚甲醛室温固定30min，0.5%结晶紫染色15min，清水洗3次，自然风干。在显微镜下进行观察，每个Transwell小室随机选取5个视野拍照，计数后取平均值。

1.2.5 细胞划痕实验

取对数生长期的HepG2细胞，以每孔8×105个细胞接种于6孔板，细胞铺满板底后，用200μL无菌的枪头尖端垂直于孔板，在每孔相同位置做线性划痕，用PBS轻轻冲洗2～3遍，然后分别用0、5、10、20、40、80μmol/L金线莲苷处理细胞，于0、24、48h在显微镜下拍照取样，采用Image J软件观察计算细胞划痕面积，细胞迁移率(%)=(0h划痕宽度-培养后划痕宽度)/0h划痕宽度×100%。

1.3 统计学方法

应用统计学软件SPSS 19.0进行数据分析，采用t检验进行组间差异的比较，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 金线莲苷对人肝癌HepG2细胞增殖活性的影响

随着金线莲苷浓度的增加，HepG2细胞的增殖抑制率也逐渐上升；40μmol/L和80μmol/L金线莲苷作用于HepG2细胞后，细胞增殖抑制率明显高于0μmol/L组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

(与0μmol/L组比较，**P<0.01)

2.2 金线莲苷对人肝癌HepG2细胞存活率的影响

随着金线莲苷浓度的增加，HepG2细胞的存活率逐渐下降；40μmol/L和80μmol/L金线莲苷作用于HepG2细胞后，细胞存活率明显低于0μmol/L组，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

2.3 金线莲苷对人肝癌HepG2细胞运动能力的影响

随着金线莲苷浓度的增加，迁移和侵袭的HepG2细胞数逐渐减少；与0 μmol/L组比较，40μmol/L和80μmol/L金线莲苷作用于HepG2细胞后，迁移和侵袭的HepG2细胞数显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

(与0μmol/L组比较，**P<0.01)

2.4 金线莲苷对人肝癌HepG2细胞迁移能力的影响

不同浓度金线莲苷作用HepG2细胞，随着作用时间的增加，划痕面积越来越小，迁移率越来越高；其中40μmol/L和80μmol/L金线莲苷作用于HepG2细胞后，细胞划痕面积明显大于0μmol/L组，而迁移率与0μmol/L组比较显著降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见图4。

(与0μmol/L组比较，*P<0.05，**P<0.01)

3 讨 论

金线莲为兰科开唇兰属植物，全草均可入药，其味平、性甘，在民间传说具有治疗百病之功效，素有"药王"之美称[7]。金线莲苷是从金线莲中分离提取到的8种丁酸衍生物葡萄糖苷之一。研究表明，金线莲苷对四氯化碳(CCl4)所致小鼠急、慢性肝损伤模型有保护作用，模型小鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性，小鼠肝脏系数、脾脏系数均显著降低[8]。肝细胞癌是由于正常肝细胞恶变所导致，其临床表现主要为进行性肝损伤及全身性症状[3]。近年来，中医药越来越多的应用于临床肝癌各阶段的治疗[9]，对金线莲苷药理活性的研究也越来越全面和深入，但目前尚未见金线莲苷对肝癌作用的相关报道。

本研究选取不同浓度金线莲苷作用于人肝癌HepG2细胞，用MTT和CCK-8检测HepG2细胞的增殖和活性，结果显示，随着金线莲苷浓度的增加，HepG2细胞的增殖抑制率逐渐上升，存活率逐渐下降，且40μmol/L和80μmol/L金线莲苷作用于HepG2细胞后，细胞增殖抑制率和存活率与0μmol/L组比较差异有统计学意义，表明金线莲苷对人肝癌HepG2细胞有细胞毒性，能明显抑制HepG2细胞的增殖活性，且具有剂量依赖性。Transwell实验和细胞划痕实验结果显示，随着金线莲苷浓度的增加，迁移和侵袭的HepG2细胞数逐渐减少，且随着作用时间的增加，细胞划痕面积越来越小，迁移率越来越高；与0μmol/L组相比，40μmol/L和80μmol/L金线莲苷作用于HepG2细胞后，迁移和侵袭的HepG2细胞数显著减少，细胞划痕面积明显较大，迁移率显著降低，表明金线莲苷能明显减弱人肝癌HepG2细胞的运动能力，抑制HepG2细胞的侵袭和迁移能力。

总之，金线莲苷能明显抑制人肝癌HepG2细胞的增殖活性，对HepG2细胞的侵袭和迁移能力也有抑制作用，且存在剂量依赖性。金线莲活性成分有多种抗癌作用机制，包括干扰细胞周期、诱导细胞凋亡、氧化应激、免疫调节等[10]，金线莲苷的抗肿瘤作用机制是否与以上机制有关仍需进一步研究，其具体的分子机制将是我们下一步研究的方向。