钒依赖型氯过氧化物酶催化脱肟反应研究*

桑贤轲，冉 蝶，吴鸣虎,**，曾志刚**

(1.湖北科技学院医学部药学院，湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院核技术与化学生物学院)

作为一种羰基官能团的保护策略与对羰基化合物进行分离和纯化的手段，肟类化合物在有机合成中具有重要地位，广泛应用于医药、农药以及相关工业合成领域。例如，哈佛大学E.J.Corey课题组曾在红霉内酯A的全合成中利用肟化-脱肟策略来保护羰基[1]；具有农用杀虫与杀菌活性的紫苏醛可通过紫苏葶的脱肟反应制备[2]；工业上香料香芹酮即以柠檬烯为原料，经香芹酮肟脱肟获取[3]。

脱除肟基再生为羰基的化学方法主要有酸性水解脱肟、还原脱肟、氧化脱肟以及电化学脱肟等[4]。这些化学脱肟方法成功实现了相关羰基化合物的高产率合成，且具有广泛的底物范围，为有机合成提供了高效成熟的工具。但是，这些方法往往伴随着苛刻的反应条件与昂贵的设备要求，或者催化剂用量较大，并且常产生大量难于降解的有机废料，对生态环境保护形成压力。相对化学脱肟方法，生物酶催化脱肟具有选择性高、反应条件温和等优点，在降低反应废物排放,即绿色合成方面优势突出，具有广阔的发展前景。

钒依赖型氯过氧化物酶(CiVCPO)可以利用过氧化氢(H2O2)、有机氢过氧化物作为氧化剂，催化烯烃化合物的羟卤化反应、卤代内酯化反应等[5-7]。本文以来源于曲霉菌(curvulariainaequalis)的CiVCPO为生物酶催化剂，通过催化模板反应苯甲醛肟脱肟探索了缓冲液pH、CiVCPO浓度、H2O2浓度等因素对脱肟反应的影响，并在此基础上与醇脱氢酶(TgADH)级联以扩大脱肟反应应用范围。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

溶菌酶(F8BBA0007，索莱宝)；Dnase I(B00B10303，北京鼎国昌盛)；还原型辅酶Ⅰ(618D021，索莱宝)；异丙醇(0511190802，上海星可)；过氧化氢(30%，20150409，国药)；氯化钠(阿拉丁，A2104024)；磷酸氢二钠(20210104，天津市大茂化学试剂厂)；柠檬酸(C11622689，麦克林)；苯甲醛肟(BLA369，毕得医药)；环己酮肟(EJ280111，安耐吉)；丙酮肟(BJ220099，安耐吉)；二苯甲酮肟(931KRGMH，安耐吉)；苯乙酮肟(BNY146，安耐吉)；环戊酮肟(OK210813T，OKA)；苯乙酮(K1919046，阿拉丁)；苯乙醇(20180806，沃凯)；苯甲醛(H2010099，阿拉丁)；环己酮(C10234465，麦克林)；环戊酮(69706947，迈瑞尔)；环己醇(C12412594，麦克林)；环戊醇(C1813034)。

BE-3200恒温混匀仪(其林贝尔仪器)；GC-2010 Pro气相色谱仪(岛津)。

1.2 实验步骤

1.2.1 苯甲醛肟储备液配制

将苯甲醛肟(12mg，0.10mmol)溶于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(100mmol/L，pH=4)中，得底物浓度为10mmol/L的储备液。

1.2.2 氯化钠储备液配制

称量0.20g NaCl转移至1mL顶空瓶，使用去离子水定容至1mL，得3.43mol/L NaCl储备液。

1.2.3CiVCPO酶催化苯甲醛肟脱肟反应

取1mL苯甲醛肟储备液于1.5mL EP管中，依次加入30.0μL NaCl储备液(终浓度为100mmol/L)，12.5μL 3.95mol/L H2O2(终浓度为50mmol/L)以及3.0μLCiVCPO(0.2mmol/L，终浓度为0.5μmol/L)。将EP管置于恒温混匀仪中，设置温度为30℃，转速为800rpm进行反应，GC监测反应进程。同样的方法合成2b-7b，在GC上均与市售标品保留时间一致。

1.2.4CiVCPO酶与TgADH级联反应

取1mL苯甲醛肟储备液于1.5mL EP管中，依次加入30.0μL NaCl储备液(终浓度为100mmol/L)，12.5μL 3.95mol/L H2O2(终浓度为50mmol/L)以及3.0μLCiVCPO(0.2mmol/L，终浓度为0.5μmol/L)。将EP管置于恒温混匀仪中，设置温度为30℃，转速为800rpm进行反应。4h后，取反应液100μL，加入500μL pH=9的100mmol/L磷酸氢二钠缓冲溶液，混匀后加入TgADH粗酶液(1mg/mL)，然后依次加入10mg/mL溶菌酶100μL(终浓度为1mg/mL)，50μL 20mmol/L NADH(终浓度为1mmol/L)，异丙醇50μL(占总体积5%)，20μL 300U/L DnaseⅠ(终浓度为6U/mL)，总体积为1mL，GC监测反应进程。同样的方法合成3c、5c、6c，在GC上均与市售标品保留时间一致。

2 结 果

2.1 pH对反应的影响

以苯甲醛肟脱肟为模板反应，探索柠檬酸盐缓冲体系pH对脱肟反应的影响。研究结果表明，缓冲溶液pH对CiVCPO催化活性具有较大的影响(图1)。当pH小于4时，目标产物苯甲醛浓度偏低，可能是酶的活性受到抑制所致；当pH等于4时，目标产物浓度显著提升；而当pH大于4时，目标产物浓度显著降低。究其原因是苯甲醛被进一步氧化生成产物苯甲酸，由此可见，缓冲溶液体系pH为4时最有利于CiVCPO催化脱肟反应发生。

2.2 CiVCPO浓度对反应的影响

在确定柠檬酸盐缓冲体系最适pH后，对CiVCPO酶的用量进行了考察，以期进一步提高反应的总转化率。CiVCPO浓度对反应的影响如图2所示。当CiVCPO浓度为1μmol/L时，催化效果最佳，产物浓度最高，约1.442mmol/L。当酶浓度提高到2μmol/L时，目标产物苯甲醛浓度仅为0.502mmol/L。总的来说，基于经济性因素考虑，CiVCPO酶浓度为0.5μmol/L时原子经济性最高。

2.3 H2O2浓度对反应的影响

在前述研究基础上进一步分析了H2O2浓度对反应的影响，结果如图3所示。从中可以看出，H2O2浓度为50mmol/L时，反应情况最好，目标产物苯甲醛浓度最高(2.29mmol/L)。但随着H2O2浓度的升高，目标产物浓度并没有随之增加而是逐渐降低，推测是过高浓度的H2O2对酶活性产生了抑制。

图3 H2O2浓度对反应的影响(产物浓度根据GC峰面积计算)

2.4 脱肟反应的底物范围及级联反应测试

在确定了最优的反应条件后，考察了CiVCPO催化脱肟反应的底物范围(表1)。总体来看，苯环上存在羟基等供电子基团时，脱肟反应较易发生，产率较高，如对羟基苯甲醛肟(2a)产率44%，接近苯甲醛肟(1a)产率的2倍。此外，酮肟类化合物整体脱肟效率高于醛肟类化合物，如在本研究中酮肟类化合物效率最低的二苯甲酮肟(4a)其产率也明显优于醛肟类化合物。

表1 脱肟反应底物范围*

为了扩大该脱肟反应的应用前景，首先选择脱肟效率较高的脂肪环类酮肟(5a，6a)与芳香族酮肟(3a)进行脱肟，并通过一锅法与TgADH进行级联，得到相应的醇类化合物，结果如表2所示。芳香族酮肟(3a)经过CiVCPO与TgADH一锅法以8.7%的产率得到1-苯乙醇(3c)；脂肪族酮肟5a、6a分别以7.3%、15.8%的产率得到环戊醇(5c)、环己醇(6c)。接着选择脱肟效率相对较低的苯甲醛肟(1a)进行了级联反应测试，同样也得到了目标化合物苯甲醇(1c)。

表2 级联反应测试*

3 讨 论

作为手性技术和绿色化学的重要组成部分，生物酶催化现已成为化学和生物学交叉领域中的研究热点，许多酶催化工艺已经用于手性药物、农药等精细化学品的生产[8]。本研究首次报道了CiVCPO催化脱肟反应，并以苯甲醛肟脱肟反应为模板，探索了柠檬酸缓冲体系pH、CiVCPO浓度和H2O2浓度对反应的影响，确定了脱肟反应最优条件为50mmol/LH2O2、100mmol/L柠檬酸缓冲液(pH=4)及0.5μmol/LCiVCPO。在此基础上，进一步测试了7种肟类底物，顺利得到了相应的醛酮产物，产率23%～98%。随后，选择4种肟类底物测试了CiVCPO与TgADH的级联反应，均得到预期的醇类化合物，拓展了反应应用范围。与传统的脱肟方法相比，CiVCPO催化情况下，使用的氧化剂为廉价的H2O2，反应后仅生成水，不会对环境造成任何危害，符合绿色化学的理念。

综上所述，本研究探索了CiVCPO催化肟类化合物制备醛酮和醇的新方法，为醛酮及醇结构单元的药物分子合成提供了新思路。