基于网络药理学解析百里醌治疗炎性肠病相关结直肠癌的分子机制*

刘 静，周 权，王 浩，夏雨晨，汤思齐，朱 薿**

(1.湖北科技学院医学部基础医学院，湖北 咸宁 437100；2.湖北科技学院医学部药学院)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是世界上第三大最常见的癌症，发病率和死亡率不断上升。目前结直肠癌主要通过外科手术、化学疗法和放射疗法治疗，但是容易复发。研究发现炎性肠病是结直肠癌发生的重要诱因之一[1]，因此，开发新的防治炎性肠病相关结直肠癌的药物刻不容缓。百里醌(thymoquinone，TQ)是从黑种草籽中提取的主要活性单体，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤作用。研究发现百里醌可抑制炎性肠病[2]和结直肠癌细胞增殖[3]，但具体作用机制尚不明确。本文通过网络药理学分析百里醌治疗炎性肠病相关结直肠癌的潜在分子机制，为百里醌的临床应用提供指导。

1 资料与方法

1.1 百里醌相关作用靶点筛选

以“Thymoquinone”为关键词，通过筛选PharmMapper[4]、STITCH[5]、SwissTargetPrediction[6]数据库得到百里醌相关潜在作用靶点。同时在GEO[7]数据库中通过关键词“Thymoquinone”筛选获得GSE122860数据集原始文件，运用GEO2R分析百里醌处理的结肠癌细胞系HCT116显著差异表达基因，并绘制火山图。上述数据库得到百里醌相关的潜在靶点基因合并去重。在Uniprot[8]蛋白质数据库中标准化蛋白质靶点信息。

1.2 筛选炎性肠病和结直肠癌的疾病靶点

分别以“inflammatory bowel disease，IBD”和“Colorectal cancer，CRC”为关键词，在TTD[9]、OMIM[10]、GeneCards[11]疾病数据库中筛选炎性肠病和结直肠癌疾病相关靶点。运用炎性肠病靶点、结直肠癌疾病靶点和百里醌预测靶点绘制韦恩图，得到药物—疾病共同靶点。

1.3 药物—作用靶点蛋白相互作用网络的构建及拓扑学分析

运用STRING[12]数据库构建药物-疾病共同靶点蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络图，同时采用 Cytoscape软件及NetworkAnalyzer工具计算PPI网络中节点的自由度(Degree)、介度(Betweeness)、聚类系数(Clustering coefficient)等拓扑学属性。以大于中位数的Degree 值为关键靶点，重构PPI图。

1.4 GO富集与KEGG通路分析

运用DAVID[13]和KEGG[14]数据库对药物—疾病共同靶基因进行GO富集与KEGG通路分析，绘制GO富集、KEGG气泡图和相关通路图。

1.5 百里醌—共同靶点—通路网络图构建

将1.4中KEGG筛选出的百里醌与疾病共同作用靶点，在疾病相关的作用通路上标注出来，再用cytoscape软件整合绘制主要的通路图，验证其多靶点、多途径协同作用于疾病的分子机制。

1.6 百里醌与靶蛋白分子对接

分别从PDB[15]和PubChem[16]数据库下载蛋白结构和百里醌结构，使用Pymol软件去除溶剂分子与配体，使用AutoDock软件进行加氢、加电子、加ROOT等操作，最后用AutoDock软件Local Search Parameters算法进行分子对接，使用Pymol软件对得到的最佳结果进行绘图。

2 结 果

2.1 百里醌潜在作用靶点筛选

在PharmMapper、STITCH、SwissTargetPrediction三个数据库中筛选百里醌潜在药物靶点，共计得到123个百里醌靶点。通过检索GEO数据库找到GSE122860数据集，该数据集中包含了3个百里醌处理HCT116细胞的干预组和3个百里醌未处理的细胞对照组。以P<0.05，logFC>1或logFC<-1为限定值，得到百里醌干预差异表达基因86个，见图1。这86个差异表达基因也可能是百里醌潜在的药物靶点。将123个由三个数据库预测的百里醌潜在药物靶点与GSE122860数据集差异表达基因合并后去除重复，最终获得207个百里醌潜在作用靶点。

(下调基因用蓝色点表示，上调基因用红色点表示)

2.2 百里醌与炎性肠病和结直肠癌疾病共同靶点筛选

通过疾病数据库合并去重后得到5256个炎性肠病疾病靶点和7611个结直肠癌疾病靶点。将百里醌药物靶点与炎性肠病和结直肠癌疾病靶点取交集，最终得到73个共同靶点，绘制韦恩图，见图2。

(TQ：百里醌；IBD：炎性肠病；CRC：结直肠癌)

2.3 共同靶点蛋白质互作网络

通过STRING数据库构建得到73个共同靶点蛋白质互作网络图，见图3A。Cytoscape软件插件Network Analyzer发现该网络包含58个节点，72个边；节点平均度值是2.7，核心靶点筛选条件设置为degree大于5.4，共筛选出3个靶点，分别是丝裂原激活的蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和CREB结合蛋白(CREB binding proein，CREBBP)，见图3B，它们与其他蛋白相互作用更强，在该网络中发挥了关键作用。

(A：STRING中绘制的靶点PPI图；B：Cytoscape绘制的PPI靶点图)

2.4 GO富集与KEGG通路分析

用DAVID数据库对药物-疾病共同靶基因进行GO富集与KEGG通路分析，以“P≤0.05”为条件筛选出具有显著性差异的基因本体和通路。GO富集分析结果发现，这些靶点与172个生物过程(biology process，BP)、25个细胞组分(cellular component，CC)，41个分子功能(molecular function，MF)有关。图4A显示了各项排名前10的条目。GO富集结果显示共同靶点主要与启动子转录调控、信号转导、细胞凋亡、非折叠蛋白结合、过氧化物合酶活性、NF-kB诱导的激酶活性、初级胺氧化酶活性、ATPase酶活性、受体拮抗活性等密切相关。KEGG分析后发现73个共同靶点主要富集在79个通路中，取前20个通路绘制图4B。结果表明，这些共同靶点主要富集在Pathways in cancer、PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、Hepatitis B、HTLV-I infection、Melanoma、Proteoglycans in cancer、Focal adhesion、Prostate cancer、FoxO signaling pathway等通路中。其中前三个通路富集的共同靶点>15，根据共同靶点在KEGG数据库获得其中PI3K-Akt信号通路(图5)和MAPK信号通路(图6)。

(A：GO分析柱状图；B：KEGG通路分析气泡图)

(红色代表的是百里醌—疾病共同靶点)

2.5 构建百里醌治疗炎性肠病相关结直肠癌通路图

将百里醌与疾病共同靶点和通路构建网络图，见图7。该网络图包含百里醌、73个共同靶点、前20个KEGG信号通路。

(红色：百里醌；内圈黄色：共同靶点；外圈黄色：相关KEGG通路)

2.6 百里醌与关键靶蛋点蛋白MAPK3的分子对接

构建百里醌与关键靶点MAPK3、EGF、CREB对接模型，计算对接后RMSD及-CDOCKER ENERGY 值。百里醌与EGF、CREB分子对接不成功，与MAPK3分子对接结果见图8。结果发现分子对接模型 RMSD 值为1.672，小于2Å；结合能为-3.1kj/mol，小于0，表明配体分子(百里醌)能和受体蛋白(MAPK3)自发地结合。提示百里醌与潜在关键靶点MAPK3具有较好的结合活性。

图8 百里醌与关键靶点MAPK3分子对接构象图

3 讨 论

本研究运用网络药理学和生物信息学方法，结合分子对接技术，筛选到73个百里醌治疗炎性肠病相关结直肠癌潜在靶点，这说明百里醌可能参与调节多个靶点发挥抗肿瘤作用。目前研究发现百里醌可通过抑制细胞增殖、迁移和侵袭，选择性抑制胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、宫颈癌和白血病等多种肿瘤的作用[17]。在许多癌症中，百里醌通过多种信号通路调节促凋亡和抗凋亡基因的表达来诱导细胞凋亡，百里醌是否调控其他蛋白介导肿瘤细胞死亡还未可知。本研究发现73个潜在治疗靶点，为探讨百里醌其他作用机制提供可能。

本研究构建的关键作用靶点PPI网络包含58个节点，72条边，得到MAPK3、EGF和CREBBP共 3个关键靶点，这3个靶点在炎性肠病和结直肠癌疾病发生发展中均发挥重要作用。研究发现MAPK3在炎性肠病的进展和发展中起关键作用[18]；在结直肠癌中研究发现MAPK3表达下降，且与结直肠癌预后有关[19]，提示MAPK3在炎性肠病相关结直肠癌中发挥重要作用。EGF是细胞增殖和组织修复的关键调节剂，在炎性肠病组织修复过程中发挥重要作用[20]，而且EGF还参与调控G/S 期细胞周期[21]，百里醌可通过抑制EGF介导G/S 期细胞周期转变来抑制细胞增殖和转化。研究发现CREBBP触发的 KDM2B 乙酰化加速了结肠癌的致癌作用[22]，而且CREBBP可能与 STAT1 相互作用参与IBD的发生发展[23]。百里醌调控CREBBP可能抑制炎性肠病相关结直肠癌进展。这些研究表明百里醌可能通过调控这3个关键靶点介导炎性肠病相关结直肠癌发生发展。

在GO功能和KEGG通路富集分析中，本研究发现百里醌主要与启动子转录调控、信号转导、细胞凋亡等密切相关；相关信号通路主要富集在PI3K-Akt和MAPK通路上。结直肠癌体内外研究[24]表明百里醌可通过抑制p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β和β-catenin来抑制LoVo结肠癌细胞中前列腺素受体EP2和EP4的活化，从而抑制细胞增殖。本研究结果证实百里醌是通过调控PI3K-Akt信号通路抑制炎性肠病相关结直肠癌细胞增殖。MAPK通路调节细胞功能，包括细胞增殖、分化、迁移和细胞凋亡。研究[25]发现MAPK信号通路的遗传变异会影响结直肠癌诊断后的风险和生存率。在结肠炎体内外模型中研究[26]已证实百里醌可通过抑制MAPK和NF-κB信号通路并转录调节 PPAR-γ表达发挥抗炎活性。结合本研究结果推断百里醌也可通过调控MAPK通路发挥抗炎性肠病相关结直肠癌的作用。由此可见，百里醌可能通过多个通路同时抑制抗炎性肠病相关结直肠癌发生发展。

本研究分子对接结果显示百里醌能与MAPK3自发结合，并形成较为稳定的构象。研究发现结肠炎症中MAPK3的表达显著增加[27]。下调MAPK3及其相关信号通路可抑制细胞增殖，由此可见，百里醌可能通过靶向MAPK3调控相关通路抑制炎性肠病相关结直肠癌细胞增殖。

综上所述，百里醌通过靶向MAPK3调控多个信号通路，以抗炎和抑制结直肠癌细胞增殖的方式治疗炎性肠病相关结直肠癌。网络药理学和生物信息学的应用为中药研究提供新的技术和方法，有助于更高效的探索药物作用靶点及通路，后续还需要体内外实验验证本研究结果。