骨髓间充质干细胞在神经修复中的研究进展

冯烨军，陈明

·综述·

骨髓间充质干细胞在神经修复中的研究进展

冯烨军，陈明

近年来，干细胞移植技术治疗神经损伤已成为神经修复研究的热点。骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）以其扩增快、多向分化潜能、再生能力强、排斥反应小、可诱导分化为类雪旺细胞等特点被用于治疗临床神经损伤的研究。本文就BM-MSCs的生物学特点、诱导分化为神经细胞的方法及其在神经修复中的应用作一综述。

骨髓间充质干细胞；诱导分化；神经修复

1 骨髓间充质干细胞的生物学特点

1.1 骨髓间充质干细胞的来源及分类

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）最早由德国病理学家Cohnheim于1867年提出，并于1968年被Friedenstein等[1]首次发现为存在于骨髓中的非造血干细胞。BM-MSCs在骨髓中含量很低，大约只占骨髓有核细胞的0.001%～0.010%。BM-MSCs有两个亚群，一种是成纤维样的细胞，另一种是呈小圆形的细胞，又称为快速自我更新细胞（rapidly self-renewing cells，RS），这两种细胞的主要区别在于其表面标记物有差异[2]。90%以上的BM-MSCs都处于G0/ G1期，属于中胚层的早期细胞。只要给予合适的培养条件，BM-MSCs便可分化为涵盖中胚层、内胚层及外胚层的细胞，如神经细胞、肝细胞、成骨细胞、肌细胞、软骨细胞、肺细胞等，因此BM-MSCs有强大的分化增殖能力。

1.2 BM-MSCs的表面标记物及免疫特性

BM-MSCs有多种表面标记物，包括生长因子、细胞因子及对应受体、黏附分子、整合素等。迄今为止，研究者们尚未发现具有高度特异性的BMMSCs表面标记物。目前被大多数人公认的表面标记物有CD105、CD106、CD29、CD166、CD71、CD44等；BM-MSCs作为一类非造血干细胞，不表达如CD34、CD14、CD45、CD11b等造血细胞的表面标记物。BM-MSCs免疫排斥较弱，其机制尚不明确。Ramasamy等[3]认为其原因是BM-MSCs抑制CD4+T、CD8+T细胞的增殖；Wang等[4]的研究指出BMMSCs较弱的免疫排斥反应可能是通过抑制C3活化，从而降低机体的免疫排斥反应。BM-MSCs的这一特性在临床上具有意义非凡的应用价值，也为治疗神经损伤提供了新的方向。

2 BM-MSCs向神经细胞的诱导分化

2.1 BM-MSCs体内诱导分化为神经细胞

1999 年Kopen等[5]将标记的大鼠BM-MSCs注射入胎鼠的侧脑室，12 d后处死，分别在大鼠前脑、小脑、纹状体、海马的分子层中找到带有标记的神经细胞，并表达GFAP、NF-M等蛋白，由此认为BMMSCs能在体内分化为神经细胞，并与胚胎神经的发生、神经干细胞的成熟、迁移方式相同。2001年，Park等[6]将转入胶质细胞来源的神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）的大鼠MSCs植入健康雌鼠体内，培养8周后建立MPTP帕金森病模型，发现转入GDNF的大鼠MSCs对黑质神经元有明显的保护作用。近几年来，Goldmacher等[7]将大鼠BM-MSCs注入大脑中动脉梗死（middle cerebral artery occlusion，MCAO）的大鼠模型后，发现BM-MSCs能分化为星型胶质细胞及小胶质细胞，并能明显促进大鼠神经功能恢复。

然而，体内诱导BM-MSCs分化存在较多缺点。由于生长环境的不稳定性，多数BM-MSCs在分化过程中不可避免地发生死亡或凋亡，少数能分化为神经细胞的BM-MSCs也并不都具有电生理功能和分泌神经递质。Xiao等[8]利用佛手柑内酯（bergapten，BP）分别通过体内外途径诱导分化BMMSCs，观察其对双侧卵巢切除大鼠骨质疏松模型的作用。体外组分为0.1、1、10 μmol/L浓度的BP进行诱导，诱导分化培养2周后移植入大鼠体内；体内组的BP剂量为20 mg/(kg·d)，喂养3月。结果发现，在体外组中BP能促进BM-MSCs内ALP的表达，且ALP浓度随BP浓度升高而升高。成骨特异性转录因子（runt-related transcription factor 2）及骨钙素（osteocalcin）在体内组及体外组中均升高，但只在体外组中通过免疫组化和免疫荧光方法检测到成骨细胞特异性转录因子（osterix）及胶原蛋白Iα1。可见，BP的体外诱导途径能比体内诱导分化出细胞因子更全面的成骨细胞，因而在临床应用更倾向通过体外途径进行BM-MSCs的诱导分化。

2.2 BM-MSCs体外诱导分化为神经元细胞

由于BM-MSCs体内诱导分化的局限性，体外诱导分化成为研究热点。2000年Woodbury等[9]利用β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol，BME）、二甲基亚砜、丁羟茴香醚、叔丁基对甲氧酚等分别诱导BMMSCs向神经元样细胞分化，首次报道BM-MSCs能通过体外诱导分化为神经元细胞。但此方法中高浓度的BME具有较强的细胞毒性，一些持反对意见的学者认为此方法观察到的神经样细胞是由于化学毒性使细胞变形的结果。此外，该方法并不能很好地用于临床治疗。目前主要的体外诱导方法有细胞因子诱导、共同培养诱导、中药参与的诱导、提高细胞内环磷腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）诱导等。

2.2.1 细胞因子诱导 BM-MSCs的表面存在多种细胞因子及对应受体，因此BM-MSCs的增殖分化受到多种细胞因子的调控。目前已有多种细胞因子被证实能诱导BM-MSCs分化为神经细胞，如碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、维甲酸（retinoic acid，RA）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）等。

bFGF是神经胶质细胞和雪旺氏细胞的促有丝分裂原，能延长培养液中多种神经元的存活时间，并刺激乙酰胆碱酰化酶的合成及突起生长，同时还可促进外周神经纤维再生。EGF是一种非特异性有丝分裂促进因子，可诱导BM-MSCs向星型胶质细胞分化，还可促进轴突延长。研究者们通常联合使用bFGF与EGF诱导BM-BMCs分化。Huat等[10]发现bFGF联合EGF能诱导BM-MSCs分化为神经祖细胞样细胞（neutral progenitor-like cells，NPCs），且检测到分化细胞质mRNA的表达远高于单纯BM-MSCs分化的对照组。

RA是维生素A的一种衍生物，主要能促进星型胶质细胞及神经元合成，还能增加神经细胞数量。RA的诱导作用与浓度相关，低浓度的RA主要诱导细胞向神经前体细胞分化，高浓度的RA能促进神经前体细胞分化为成熟的神经细胞。目前研究者多采用全反式维甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）联合其他细胞因子进行BM-MSCs的诱导分化。Bi等[11]将BM-MSCs加入不同浓度的ATRA（0.01～100 μmol/L）24 h后置入改良的神经诱导培养基，发现1 μmol/L ATRA能明显提高神经元的分化率及存活率。

BDNF是一种具有营养神经作用的蛋白质，BDNF与其受体在神经系统中广泛存在，主要在中枢神经系统中表达。Liu等[12]发现转入BNDF的BM-MSCs治疗豚鼠耳蜗螺旋神经节细胞（cochlear spiral ganglion cells）损伤比单纯BM-MSCs效果更好。

2.2.2 共同培养诱导 BM-MSCs与某些神经细胞在体外共同培养时，在这些神经细胞的诱导作用下，BM-MSCs会分化为特定的神经细胞，这一方法可认为是体内诱导方法的体外化。其主要机制可能是神经细胞分泌的各种细胞因子、神经递质等参与BM-MSCs信息处理过程，调控BM-MSCs分化成神经细胞。Zurita等[13]将大鼠坐骨神经来源的雪旺细胞与大鼠BM-MSCs共同培养（相互不接触）后发现，4 h后（10±2.1）%的BM-MSCs表达巢蛋白（Nestin），其形态类似于成纤维细胞；8 h后更多的细胞表达巢蛋白，但不表达其他神经标记物如NF-200、GFAP、β-Ⅲ-微管蛋白等，细胞形态开始发生变化；培养1～2周后，多数细胞分化为神经元样细胞，神经标志物如NF-200、GFAP、β-Ⅲ-微管蛋白的数量明显增多，而巢蛋白逐渐减少。这说明BM-MSCs的分化受到可溶性因子的调控，并非与神经细胞融合。

2.2.3 中药参与的诱导 中药作为我国特有的药物，在我国许多医学研究方面都有独到之处。我国许多研究者成功利用中药诱导BM-MSCs分化为神经细胞。近年来，聂蕾等[14]应用当归红芪超滤膜提取物联合β-巯基乙醇诱导小鼠BM-MSCs分化，发现联合诱导能有效提高BM-MSCs分化率，且分化细胞有较强的增殖能力。李玉美等[15]利用bFGF预诱导后的BM-MSCs加入丹参酮ⅡA继续培养，在培养得到的神经样细胞中检测到神经元特异性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）阳性率为（75.60± 2.31）%，巢蛋白呈一过性表达并随培养时间递减，不表达神经胶质纤维酸性蛋白，说明此联合诱导方案能定向诱导神经元样细胞分化。邓秀君[16]发现中药蝮龙抗栓丸联合BM-MSCs移植在治疗大鼠MCAO中能显著提高大鼠脑内GDNF的水平。

2.2.4 提高细胞内cAMP浓度的诱导 cAMP是细胞内参与调节功能的第二物质信使。Deng等[17]的实验发现，提高BM-MSCs细胞内cAMP浓度，可诱导BM-MSCs分化为神经元样细胞并检测到NSE等标记物表达水平上调。研究者们认为其机制可能与cAMP浓度升高直接激活PKA通路有关。也有研究者认为，此类方法对于BM-MSCs向成熟神经细胞分化作用有限，仅能诱导BM-MSCs分化为早期的神经元样细胞。

3 BM-MSCs在神经修复中的应用

神经损伤主要分为中枢神经损伤及外周神经损伤。BMMSCs移植治疗神经损伤是研究的热点。随着研究的深入，越来越多的新方法不断涌现。

3.1 单一BM-MSCs移植

单一的BM-MSCs移植主要应用于非节段性神经损伤的治疗，如帕金森病（Parkinson’s disease，PD）、阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）、亨廷顿氏病（Huntington’s disease，HD）、脑缺血等。Hoban等[18]将高表达GDNF的BM-MSCs（GDNF-MSCs）体外培养后注入SD大鼠的左侧纹状体，1 d后将内毒素注入大鼠左侧大脑黑质中构建SD大鼠PD模型，移植21 d后发现GDNF-MSCs对局部神经有保护作用。赵慧新等[19]通过移植BDNF转染的BM-MSCs治疗AD大鼠，发现其对AD大鼠的认知有改善作用，且能促进海马区NMDARI的表达。Sánchez等[20]将BM-MSCs移植入喹啉酸纹状体损伤SD大鼠模型中，检测到其纹状体及大脑皮质内BDNF明显上升，并认为BM-MSCs移植是一种有可能治愈HD的方法。YE等[21]发现BM-MSCs植入MCAO模型大鼠中后能促进受损区域脑白质的再生和增殖。Jo等[22]将BM-MSCs移植入嗅上皮（olfactory epithelium，OE）缺损模型的大鼠，4周后发现缺损的OE恢复到正常水平，且嗅觉标志蛋白（olfaction marker protein，OMP）较对照组明显上升，NGF及BDNF的表达略有下降。刘双凤等[23]通过比较尾静脉注射PBS与BM-MSCs治疗MCAO新生SD大鼠发现，后者可改善局灶性脑缺血大鼠神经功能，可能与移植后脑组织中TNF-α和IL-10的表达有关。

3.2 BM-MSCs复合组织工程神经移植

自体神经移植术较早应用于节段性神经缺损的治疗，但由于其存在供体神经来源有限、供体区永久性神经功能障碍等缺点，因此构建组织工程神经替代自体神经已成为目前研究的趋势。组织工程神经的三要素是：支架、种子细胞和因子。构建组织工程神经的生物材料支架即人工神经移植物，种子细胞主要是雪旺细胞（Schwann cell，SC）或具有类似功能的细胞，使用较多的因子是神经营养因子。May等[24]采用种植大鼠坐骨神经SC的硅胶管作为阴茎海绵体神经（cavernous nerve，CN）5 mm缺损的修复供体，3月后实验组大鼠90%有勃起反应。但由于硅胶管不可降解，长期留存于局部组织可导致异物反应、神经生长障碍或压迫再生组织等，临床难以应用，研究者们开始探索可降解的人工神经支架。Hisasue等[25]应用多聚L-乳酸和E-己内酯的共聚物结合胶原海绵的人工支架对CN 4 mm缺损进行修复，结果发现该人工支架较单纯生物降解物更有利于勃起功能的恢复。Connolly等[26]采用同种异体的大鼠去细胞神经支架（acellular nerve scaffold，ANS）修复CN 5 mm缺损，术后12周55%实验组大鼠CN功能完全恢复，且实验组CN内观察到再生的神经纤维。近年来，Chen等[27]应用去细胞脊髓支架复合5-溴脱氧尿苷标记的BM-MSCs移植入大鼠脊髓损伤（spinal cord-injured，SCI）模型中，8周后免疫荧光检测到部分BM-MSCs分化为神经胶质细胞，复合BM-MSCs的脊髓支架不仅能抑制细胞凋亡，而且还能促进脊髓功能恢复。Zhou等[28]运用BM-MSCs与SC共同复合去细胞神经支架治疗大鼠10 mm坐骨神经缺损，16周后发现BM-MSCs与SC联合组疗效优于单一BM-MSCs或SC移植组，并且复合组的疗效与自体神经移植组相当。Onuma-Ukegawa等[29]研究发现，蜂窝胶原蛋白海绵（honeycomb collagen sponge，HC）支架复合BM-MSCs能更好地促进大鼠脊神经节（dorsal root ganglion，DRG）的体外再生，3 mm的HC支架复合BM-MSCs移植治疗SCI模型大鼠能使运动和感觉功能恢复更好。

4 存在的问题及研究前景

BM-MSCs在神经修复方面的应用前景已得到广大研究者的肯定，但仍存在一些问题：如BM-MSCs在体内不同微环境中分化成熟的机制尚不明确；BM-MSCs有无转化为恶性细胞的可能；BM-MSCs体内诱导是否存在更加高效可行的方法，BMMSCs复合组织工程神经治疗长距离周围神经损伤的研究仍不成熟；在一些疾病的最佳治疗时间内如何快速制备BM-MSCs从而提高疗效等。BM-MSCs为一些难治性的神经系统疾病及不可逆性神经损伤提供了新的治疗方向，随着研究的深入，BM-MSCs一定能在神经系统疾病的治疗中发挥巨大作用。

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（本文编辑：王晶）

R741；R741.05

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.05.019

东南大学医学院南京 210009

国家自然科学基金青年基金（No.81300472）

2015-11-1

陈明mingchenseu@126. com