右美托咪定改善大鼠脑缺血再灌注后认知功能障碍

毕江江，王金韬，罗爱林

·论著·

右美托咪定改善大鼠脑缺血再灌注后认知功能障碍

毕江江，王金韬，罗爱林

目的：观察右美托咪定（Dex）对大鼠脑缺血再灌注后认知功能障碍的影响。方法：64只SD大鼠随机分为MCAO组、假手术组、Dex组、对照组，每组16只。建立脑缺血模型，MCAO组大脑中动脉阻塞60 min后再灌注，假手术组仅分离血管，Dex组术前腹腔注射Dex 100 μg/kg，其他组经腹腔注射相同体积生理盐水，对照组仅接受全麻20 min，不予手术处理。24 h后ELISA法测定各组大鼠额叶皮质IL-1β、IL-6、TNF-α的表达。术后第7天开始Barnes迷宫测试观察大鼠空间学习记忆功能。结果：MCAO组IL-1β、IL-6、TNF-α的表达比假手术组、对照组和Dex组均增高（均P＜0.05），Dex组的炎性因子表达与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；MCAO组大鼠在Barnes迷宫进入目标洞时间比假手术组、对照组和Dex组均延长（均P＜0.05），Dex组与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：Dex能降低大鼠脑缺血术后中枢神经炎性因子的表达，改善其术后认知功能障碍。

右美托咪啶；认知功能障碍；缺血再灌注

缺血缺氧性脑病占所有脑血管疾病的2/3左右，脑缺血超过1 h，即出现不可逆性脑损伤，并出现运动、感觉及认知障碍，目前缺乏确切的综合治疗手段。近年来，诸多研究表明右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）对神经系统具有保护作用[1]。本实验观察Dex应用于大鼠脑缺血性损伤后认知功能、神经炎性因子表达的变化，为其可能的作用机制提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2月龄雄性SD大鼠64只，体质量300～400 g，随机分为对照组、假手术组、MCAO组、Dex组各16只。

1.2 方法

术后24 h检测炎性因子表达的大鼠共24只，每组6只；术后第7天进行Barnes迷宫训练的大鼠共40只，每组10只。

1.2.1 麻醉及手术方法 大鼠吸入3%异氟醚，翻正反射消失、无疼痛反应后气管插管及机械通气，吸入100%O2，呼吸参数为潮气量2 mL，呼吸频率65次/分，维持麻醉吸入2%异氟醚，监测大鼠心率、脉氧饱和度。Dex组经腹腔注射Dex 100 μg/kg，对照组、假手术组和MCAO组经腹腔注射相同体积生理盐水。大鼠仰卧位固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）和颈内动脉（internal carotid artery，ICA），用微动脉夹暂时夹闭ICA，近心端结扎CCA、ECA，将拴线插入到ICA的深度为18 mm时结扎CCA远心端。整个麻醉及手术过程20 min，大鼠翻正反射恢复后拔管。缺血60 min后抽出拴线。假手术组在全麻下做颈正中切口，分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，不造成缺血，缝合切口后苏醒。对照组予全麻20 min后苏醒，无手术及药物处理。

1.2.2 提取脑组织标本 术后24 h，大鼠经3%异氟醚吸入麻醉，翻正反射消失、无疼痛反应后，用4℃生理盐水心脏灌注5 min，迅速分离大脑额叶皮质，每例标本约重80 mg，-80℃保存。

1.2.3 ELISA法测定炎性因子 将大鼠额叶皮质分别溶解于20 mmol/L的Tris-HCl（pH值7.4）中，每毫克脑组织使用5 μL裂解液。冰上充分研磨后超声裂解，4℃下13 000 rpm离心25 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度，按照ELISA试剂盒说明书步骤测试IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平（ELISA试剂盒均购于英国Abcam公司）。ELISA测试结果与对应蛋白浓度比值为炎性因子的相对表达水平。

1.2.4 Barnes迷宫测试 手术后第7天采用Barnes迷宫法观察大鼠的空间学习记忆能力。将大鼠放在一个白色的圆形平台上，平台的边缘均匀分布20个圆形小洞，只有其中一个洞与一个暗格相连，为目标洞。将大鼠用避光的圆筒罩住，打开白炽灯直射平台，10 s后移走圆筒，开启85 dB的噪音，观察大鼠在平台上的运动轨迹。大鼠会随机或有目的地探索平台周边的洞口，记录大鼠进入目标洞的时间。若3 min后仍不能找到目标洞，则手动把大鼠放入目标洞，盖上遮光板，关掉噪音，让其在暗格里停留2 min。每只大鼠每天训练2次，一共训练4 d。自开始训练起第5天和第12天分别测试一次，记录每只大鼠进入目标洞的时间。

1.3 统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件分析数据，计量资料以（均数±标准差）表示。行为学训练期结果采用双向重复测量方差分析，其余结果组间比较采用单向方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组额叶皮质炎性因子表达水平比较

脑缺血再灌注24 h后MCAO组大鼠皮质IL-1β、IL-6、TNF-α的表达高于对照组、假手术组和Dex组（均P＜0.05）；Dex组大鼠皮质炎性因子的表达与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），低于MCAO组（P＜0.05），见图1。

图1 各组大鼠脑缺血再灌注24 h后额叶皮质IL-1β（A）、IL-6（B）、TNF-α（C）表达水平比较

2.2 各组大鼠Barnes迷宫测试结果比较

MCAO组进入目标洞时间较对照组、假手术组和Dex组延长（均P＜0.05）；Dex组进入目标洞时间与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），低于MCAO组（P＜0.05），见图2。

3 讨论

Dex是一种新型的高选择性α2肾上腺素能受体激动药，通过激动突触前膜α2肾上腺素受体，抑制去甲肾上腺素的释放，起到抗焦虑、镇静的作用，同时阻断疼痛信号的传导，其安全性和有效性使之成为一种崭新的麻醉辅助用药而广泛应用于临床[2]。Dex主要作用于蓝斑核，该部位主要负责觉醒、睡眠、焦虑和药物成瘾的戒断症状[3]。因此，其镇静和抗焦虑等中枢作用与通过γ-氨基丁酸系统起作用的GABA类镇静药不同，用药后一般不产生认知功能障碍。α2受体激动剂的神经保护机制还未完全阐明，目前的假说包括Dex可减少缺血引起的肾上腺素过度分泌，黏着斑激酶表达增加[4]，中枢性谷氨酸盐释放的调节，减少Ca2+进入以及凋亡等[5]。Sato等[6]在麻醉后脑缺血大鼠模型中发现，使用Dex能明显改善大鼠脑缺血现象。Tanskanen等[7]及Engalhard等[8]发现Dex的作用呈剂量依赖性，在短暂性夹闭动物大脑中动脉过程中，大剂量组的脑梗死面积较中剂量和小剂量组少。

图2 各组第5天（A）、第12天（B）Barnes迷宫测试结果比较

近年来，炎性反应在脑缺血再灌注的过程中发挥的作用受到较多的关注。大量研究显示脑缺血再灌注时小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元及白细胞、巨噬细胞可释放大量炎性因子，如IL-1β、IL-6、TNF-α等[9]，同时激活免疫细胞和内皮细胞，诱导细胞黏附分子的表达，增加内皮细胞和中性粒细胞的附着，促进其他炎性因子的产生和释放，激活级联反应加重脑损伤。本实验发现在缺血再灌注损伤动物实验中，Dex组大鼠脑皮质IL-1β、IL-6、TNF-α含量均低于MCAO组，提示Dex可能抑制炎性细胞因子的生成，从而抑制炎症反应，减轻缺血再灌注损伤。Barnes迷宫实验中Dex组大鼠进入目标洞时间也少于MCAO组，提示该组大鼠空间学习记忆功能优于MCAO组，Dex可能改善脑缺血后认知功能障碍。Dex对于脑缺血再灌注损伤的炎症抑制作用是否呈剂量依赖性，以及其对人体神经保护作用的具体机制还有待进一步研究。

[1]Rodríguez-González R,Sobrino T,Veiga S.Neuroprotective effects of dexmedetomidine conditioning strategies:Evidences from an in vitro model of cerebral ischemia[J].Life Sci,2016,144:162-169.

[2]Civantos Calzada B,Aleixandre de Artiñano A.Alpha-adrenoceptor subtypes[J].Pharmacol Res,2001,44:195-208.

[3]Hunter JC,Fontana DJ,Hedley LR,et al.A Assessment of the role of alpha2-adrenoceptor subtypes in the antinociceptive,sedative and hypothermic action of dexmedetomidine in transgenic mice[J].Br J Pharmacol, 1997,122:1 339-1 344.

[4]Dahmani S,Rouelle D,Gressens P,et al.Effects ofdexmedetomidine on hippocampal focal adhesion kinasetyrosine phosphorylation in physiologic and ischemic conditions[J].Anesthesiology,2005,103:969-977.

[5]Ma D,Rajakumaraswamy N,Maze M.alpha2-Adrenoceptor agonists: shedding light on neuroprotection?[J].Br Med Bull,2005,71:77-92.

[6]Sato K,Kimura T,Nishikawa T,et al.Neuroprotective effects of acombination of dexmedetomidine and hypothermia afterincompletecerebral ischemia in rats[J].ActaAnaesthesiol Scand,2010,54:377-382.

[7]Tanskanen PE,Kyttä JV,Randell TT,et al.Dexmedetomidine as ananaesthetic adjuvant in patients undergoing intracranial tumoursurgery:a double-blind,randomized and placebo-controlled study[J].Br J Anaesth,2006, 97:658-665.

[8]Engalhard K,Werner C,Eberspacher E,et al.The effect of the alpha2-agonist dexmedetomidine and the N-methyl-D-aspartate antagonist S(+)-ketamine on the expression of apoptosis-regulating proteins after incomplete cerebral ischemia and reperfusion in rats[J].Anesth Analg,2003,96: 524-531.

[9]徐雅洁.右美托咪啶对老年脑肿瘤患者开颅手术后脑保护机制的研究[J].神经损伤与功能重建,2015,10:312-314.

（本文编辑：王晶）

Neuroprotective Effects of Dexmedetomidineto on Cognitive Dysfunction after Cerebral Isch-emia-reperfusion Injury in Rats

BI Jiang-jiang,WANG Jin-tao,LUO Ai-lin.
Department of Anesthesiology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science&Technology,Wuhan 430030, China

Objective:To investigate the effect of dexmedetomidine(Dex)on cognitive dysfunction after cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.Methods:Forty-eight SD rats were randomly divided into groups of control,surgery and Dex,with 16 rats in each group.The surgery and Dex groups were subjected to middle cerebral artery occlusion(MCAO).The Dex group received Dex via intraperitoneal injection at a dose of 100 μg/kg before MCAO operation.The groups of surgery and control were given normal saline of same volume.The control group received 20 min’s anesthesia without surgery.The IL-1β,IL-6 and TNF-α levels in cerebral cortex were determined with enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)at 24 hours after surgery.On day 7 after surgery,rats were assessed by Barnes maze test.Results:The IL-1β,IL-6 and TNF-α levels in the surgery group were significantly higher than those in the Dex and control groups(allP＜0.05).The latency to find the target box in the surgery group was much longer than that in the Dex treatment and control groups(allP＜0.05).Conclusion:Dex may decrease the expression of neuroinflammatory factors after cerebral ischemia in rats,and improve the cognitive function.

Dexmedetomidine;cognitive dysfunction;ischemia-reperfusion injury

R741;R741.02

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.03.001

华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科

武汉 430030

国家自然科学基金（No.30901390）

2016-01-24

罗爱林

alluo@tjh.tjmu.edu. cn