自体骨髓间充质干细胞移植治疗神经系统疾病的临床研究

时间：2024-07-28

沈华超，丁海霞，李晓波，曹菁菁，马虎龙，张云云，吴春平，孙波，王杰,，丁新生,

沈华超1,2，丁海霞3，李晓波2，曹菁菁2，马虎龙4，张云云2，吴春平4，孙波2，王杰2,3，丁新生1,2,3

目的：探讨应用自体骨髓间充质干细胞（MSCs）移植治疗神经系统疾病的临床疗效。方法：收集患者24例，包括持续植物状态（PVS）12例、运动神经元病11例、桥脑小脑萎缩1例。入院后经骨髓穿刺采集自体骨髓，当天分离回输1×108个单个核细胞，剩余细胞进行MSCs培养扩增，待MSCs数量增至约1×108个细胞后收集细胞，经腰椎穿刺推注。治疗前后对患者神经功能变化分别进行评价。结果：12例PVS患者中，PVS评分提高、肌力改善5例；11例运动神经元病患者和1例橄榄桥脑小脑萎缩患者中，肌力、构音障碍改善5例。结论：MSCs移植治疗可以部分缓解神经系统疾病的症状，近期疗效明显，无不良反应，远期疗效还需进一步随访和观察。

骨髓间充质干细胞；移植；持续植物状态；运动神经元病

脑卒中和脑外伤后的持续性植物状态（persistent vegetable state，PVS）、运动神经元病的病死率和致残率很高，疗效不尽如人意，给家庭和社会带来沉重的负担。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种主要存在于骨髓中的非造血干细胞，是中胚层发育的早期细胞。通过体外贴壁培养加以分离，分化为多种造血以外的组织细胞，特别是中胚层和外胚层来源的组织细胞。由于其来源方便、扩增相对容易、自体移植不存在免疫排斥反应；不存在胚胎干细胞、神经干细胞有可能涉及到的伦理道德问题，不必使用大量免疫抑制剂；易于外源基因的转染和表达，因此MSCs有望成为较理想的神经系统疾病细胞和基因治疗理想的种子细胞及组织再生的工具，在临床应用上受到越来越广泛的关注。

目前自体MSCs移植已用于治疗终末期充血性心衰、心肌梗死、糖尿病足、下肢缺血性疾病等及神经系统疾病如脑卒中、阿尔茨海默病、脊髓损伤等。本研究在体外实验成功培养MSCs的基础上，应用自体MSCs移植治疗PVS12例和运动神经元病11例、桥脑小脑萎缩1例，现将治疗过程和随访情况报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2003年10月至2013年11月江苏省人民医院和南京紫金医院的住院患者24例，其中PVS12例、运动神经元病11例、桥脑小脑萎缩1例，见表1、表2。

1.2 方法

1.2.1 材料肝素（购于常州千红生化制药股份有限公司），Ficoll、氯化铵、人MSCs基础液体培养基、人MSCs培养基添加物（购于加拿大Stem Cell公司）。

1.2.2 骨髓采集方法患者或其家属同意并签署手术协议书和干细胞治疗知情同意书后，在严格无菌条件下行骨髓穿刺术。在局部麻醉下，取髂骨上缘为穿刺点，抽取骨髓约50 mL。术中监测患者血压等生命体征变化，术后在监护病房观察24 h。

1.2.3 MSCs细胞的分离、提取、培养采集的骨髓用肝素抗凝，采集后立即送实验室，用Ficoll密度梯度离心法去除红细胞、多核细胞、血清和细胞碎片，分离获得骨髓单个核细胞（mononuclear cells，MNCs）。所有骨髓均经涂片、染色、镜检明确细胞无异常，MNCs分离液均取样进行活细胞计数。取1×108个细胞加入1%白蛋白3 mL，腰穿当天回输。其余细胞按2～5×107/皿接种，每3～4 d换液。待MSCs细胞长至约1×108个细胞时（平均10 d），收集细胞后腰穿回输1次。

1.2.4 治疗方法和评价提取的MNCs悬液、分离培养的MSCs悬液均经腰椎穿刺蛛网膜下腔内一次性注射。其中11和14号患者各接受2次细胞移植。干细胞治疗前和治疗后1 d、1月、6月、2年分别评价患者神经功能及不良反应。

2 结果

自体MSCs治疗因车祸所致颅脑外伤后PVS 5例，PVS评分较前提高2例，刺激后四肢有不自主活动及头部转动，眼球震颤及吞咽动作，失访1例；治疗脑出血后PVS 4例，治疗后2周仍神志不清2例，但眼球跟踪较前明显，有时对声音刺激表现流泪等情感反应，随访中发现该病例能对家属的言语用眼球活动示意，失访1例；治疗脑炎后PVS 1例，出院时其PVS评分较前提高4分，神志未清，无情感反应及完成指令动作，四肢肌张力较高，刺激时有肌强直发作；治疗因皮质纹状体变性后PVS 1例，其肌张力有所下降，但仍意识不清，脑电图及诱发电位无明显改善，见表1。治疗运动神经元病11例、桥脑小脑萎缩1例，5例有不同程度的肌力、构音障碍改善，见表2。24例患者中共有2例移植干细胞后出现一过性发热，无其他不良反应。

3 讨论

近年来，神经细胞移植被用来修复或重建神经组织因疾病和损伤而造成的功能缺失。如用胎儿中脑细胞移植治疗Parkinson病，部分患者的症状明显改善，PET检查脑内多巴胺的合成增加[1,2]。但胎儿细胞来源明显受到许多因素如免疫反应等的限制，很难广泛应用。早在19世纪中叶，就有人发现骨髓具有成骨能力，MSCs具有高度增殖、自我更新和多向分化潜能，在不同诱导条件下，可分化为软骨、骨、骨骼肌、肌腱、脂肪等中胚层细胞，同时还可以向外胚层的神经细胞和内胚层的肝卵圆性细胞分化[3,4]。MSCs移植在脑创伤[5,6]、脑梗死[7,8]等的动物实验治疗中，都取得明显的效果；近几年，其在脑复苏[9]、脑卒中[10,11]、脊髓损伤[12]等的临床应用中也取得一定的疗效。本研究采用蛛网膜下腔途径移植MSCs，对PVS及运动神经元病等的临床疗效及不良反应进行初步观察，取得了一定的临床效果。由于运动神经元病为神经退行性疾病，多发生于老年患者，从老年患者分离提取的骨髓干细胞活力相对较差，可能影响该部分患者的骨髓干细胞移植治疗效果。

本研究采用的腰椎穿刺蛛网膜下腔移植的方法，循脑脊液循环能够直接进入脑组织内，有利于进一步迁移、分化，从而修复缺损。诸多动物实验已证实MSCs移植治疗后，神经功能缺失症状能明显改善。大鼠永久性脑缺血后当天和第3天尾静脉注射MSCs，均可改善神经功能缺损评分，同时降低死亡率，减少梗死体积，促进血管再生及侧脑室下区的细胞增殖[13]。新生大鼠脑缺血缺氧后MSCs移植可减少梗死体积，增加神经元和神经胶质细胞分化，抑制炎性细胞的增加，并促进神经功能恢复[14]，大鼠永久性脑缺血后立即静脉注射MSCs，14 d及28 d的神经功能缺损评分较对照组均有所提高，并发现基质细胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）及CXCR4的表达上调，推测MSCs可能通过SDF-1/CXCR4调节其从嗅球迁移至病灶区，从而改善神经功能[15]；Yoo等[16]认为MSCs促进神经功能恢复，一方面由于其增加了内源性神经再生，另一方面由于其能保护新生的神经元免受损害。其可能机制具体有以下几个方面：替代作用，MSCs可分化为神经样细胞，取代已死亡的神经细胞；支持作用，MSCs能分泌脑源性神经营养因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子和白介素等营养因子，如增加缺血脑组织的TNF-α、IL-10等因子的释放发挥抗炎作用[17]，还有研究显示MSCs移植后可产生细胞外基质对神经元发挥保护作用[18]；诱导作用，Liu等[19]研究证实缺血缺氧的环境下，脑微血管内皮细胞诱导MSC分化为内皮细胞，同时MSCs可通过旁分泌的作用促进脑微血管内皮细胞的增殖及迁移。

表1 PVS患者的临床资料

MSCs以其他来源细胞无法比拟的优势成为细胞和基因治疗神经系统疾病理想的供体细胞，目前已显示出其不凡的分化能力和一定的治疗作用。进一步探索决定MSCs向神经系细胞分化的关键基因，发现影响其分化的细胞、免疫、分子学机制，找到调控细胞迁移和整和的方法等是在真正临床运用MSCs治疗神经系统疾病之前所必须要完成的。相信随着对MSCs研究的不断深入，中枢神经系统疾病的细胞基因治疗将会有广阔的前景。

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表2 神经变性病患者的临床资料

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（本文编辑：王晶）

Clinical Study of Treating Incurable Neurologic Diseases with Autologous Mesenchymal Stem Cells

SHEN Hua-chao1,2,DING Hai-xia3,LI Xiao-bo2,CAO Jing-jing2,MA Hu-long4,ZHANG Yun-yun2,WU Chun-ping4,SUN Bo2,WANG Jie2,3,DING Xin-sheng1,2,3.
1.Department of Neurology,BenQ Hospital Affilicated to Nanjing Medical University,Nanjing 210019,China;2.Institute of Neurology,BenQ Hospital Affilicated to Nanjing Medical University,Nanjing 210019,China;3.Department of Neurology,The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China;4.Department of Internal Medicine,Nanjing Zijing Hospital,Nanjing 210007,China

Objective:To explore the clinical effects of auto-mesenchymal stem cells(MSCs)transplantation on treatment of patients with incurable neurologic diseases.Methods:The 24 patients with persistent vegetative state(n=12),motor neuron disease(n=11)and olivoponto-cerebellar atrophy(n=1)were harvested for bone marrow.The mononuclear cells(MNCs)were isolated and 1×108MNCs were injected into subarachnoid space by lumbar puncture one the same day.The remaining cells were cultured,amplified and then injected into subarachnoid space by lumbar puncture when MSCs were increased to 1×108or so.The neurologic functions were observed before and after MSCs transplantation.Results:Five of 12 PVS patients had elevated PVS score at various degree and improved motor function.Among 11 motor neuron disease and 1 olivopontocerebellar atrophy patients,5 patients had some improvement at various degrees in muscle strength,and speech.Conclusion: There were significant clinical effects in treatment of neurologic diseases with MSCs transplantation in a short term,and with no severe side effects and complications.The long-term clinical effect needs more observation with larger samples.

mesenchymal stem cells;transplantation;persistent vegetable state;motor neuron disease

R741;R741.05

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.03.003

1.南京医科大学附属明基医院神经内科

南京 210029

2.南京医科大学明基神经病学研究所

南京 210029

3.南京医科大学第一附属医院神经内科

南京 210029

4.南京紫金医院内科

南京 210007

国家自然科学基金（No.30971022）