武汉地区缺血性脑卒中患者MTHFR基因多态性分布分析

韩瑞玲，李艳

武汉地区缺血性脑卒中患者MTHFR基因多态性分布分析

韩瑞玲，李艳

目的：探讨武汉地区缺血性脑卒中患者亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）基因多态性的分布。方法：选取缺血性脑卒中患者167例为卒中组，健康体检者110例为对照组。通过基因芯片法检测缺血性脑卒中相关的MTHFR基因677位点，并按基因型别分为野生型（C677C）、杂合型（C677T）、纯合型（T677T）。结果：卒中组中野生型22.2%，杂合型43.1%，纯合型34.7%。与对照组相比，野生型显著减少，纯合突变型显著增多，有显著性差异（P＜0.01）。不同性别脑卒中患者在MTHFR基因分型上差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：武汉地区缺血性脑卒中患者中分布有较多的纯合突变型MTHFR基因。

缺血性脑卒中；亚甲基四氢叶酸还原酶；MTHFR基因；基因多态性

缺血性脑卒中是我国目前严重威胁中老年人生命与健康的主要疾病之一。高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血症是此类疾病的独立危险因素之一[1]。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是Hcy在人体内代谢途径中的关键酶，MTHFR基因最常见的677位点的多态性将导致该酶含量不足和（或）活性下降，从而造成Hcy在体内蓄积，引起高Hcy血症，损伤血管内皮细胞和平滑肌细胞，同时通过诱导红细胞促凝活性，使机体处于高凝状态，促进血栓形成[2-4]。本研究应用基因芯片法检测MTHFR基因677位点多态性，研究MTHFR基因多态性在武汉地区缺血性脑卒中患者中的分布。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月至2015年12月在我院神经内科住院的急性缺血性脑卒中患者167例为卒中组，均经颅脑CT或/和MRI确诊，符合2014年中华医学会神经病学分会修订的中国急性缺血性脑卒中诊治指南的诊断标准[5]，男89例，女78例；年龄43～82岁，中位年龄61岁。另选取健康体检者110例为对照组，男54例，女56例；年龄40～80岁，中位年龄59岁。2组均否认家族遗传病病史，汉族，无血缘关系，均排除原发性高血压病、冠心病、糖尿病、癌症、肾功能衰竭等。2组年龄、性别比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 试剂和仪器

e-Hyb全自动杂交仪、BE-2.0生物芯片识读仪、全血基因组DNA提取试剂盒、MTHFR基因检测DNA微阵列芯片法试剂盒、基因芯片图像分析软件（Baio Array Doc-tor V 2.0）（购于上海百傲科技有限公司），T100 PCR仪（购于美国Bio-rad公司），台式高速离心机（购于美国Thermo公司），金属浴（购于杭州奥盛仪器有限公司），涡旋振荡器（购于江苏海门其林贝尔仪器厂）。

1.3 方法

1.3.1 外周血DNA提取 静脉采集受试者外周血1～2 mL（EDTA抗凝管抽取，4℃保存），按照DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取和纯化。

1.3.2 PCR扩增 将不同浓度MTHFR基因特异性荧光引物（生物素标记）进行PCR反应，对DNA标本扩增，使扩增出的目的片段以单链为主。PCR扩增总反应体系为25 μL，即取MTHFR扩增液22 μL，加入反应液A 1 μL和DNA模板2 μL。扩增条件：50℃5 min；预变性94℃5 min；变性94℃25 s，56℃25 s，72℃25 s，35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物置于4℃冰箱储存。

1.3.3 杂交显色 杂交显色原理是将扩增产物（带生物素标记）与固定在醛基基片上的特异性MTHFR基因型检测探针进行特异性杂交反应，然后通过酶促显色反应，使特异性杂交信号呈现出颜色。具体操作如下：取出杂交显色试剂盒。将反应液B低速离心，吸取10 μL加入杂交缓冲液瓶中混匀，备用。临用前，取出1支抗体，低速离心，加入1 mL抗体稀释剂，振荡混匀，制成抗体使用液，备用。吸取190µL杂交缓冲液，加入10 μL MTHFR扩增产物，混匀，制成杂交反应液，加入试管中，放入试管架。准备各管试剂于2 mL离心管中，并将准备好的离心管插入试管盒中，将试管架放入杂交仪中，按照说明书设置并运行杂交程序。

1.3.4 基因分型结果分析 使用BE2.0生物芯片识读仪扫描芯片，得到样品DNA与MTHFR（677）基因位点的野生型和突变型探针杂交，不同的探针信号杂交后显示出不同的基因位点图像；采用基因芯片图像分析软件进行图像扫描与数据分析，判断待检样品的基因型，输出检测结果。根据分型检测说明书的定义说明，MTHFR基因677位点的野生型为CC，杂合突变型为CT，纯合突变型为TT。其中，CC型为MTHFR酶222位丙氨酸纯合子，酶活性正常；CT型为MTHFR酶222位丙氨酸/缬氨酸杂合子，酶活性居中；TT型为MTHFR酶222位缬氨酸纯合子，在37℃时活性比CC编码的酶活性降低50%～60%[6]。

1.4 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。采用Hardy-Weinberg平衡定律计算各等位基因频率分布数据的可靠性。

2 结果

MTHFR等位基因的频率符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2=2.562，P=0.109），故认为群体基因遗传平衡，数据来自同一孟德尔群体。基因多态性采用生物芯片检测并分类，见图1。性别对于MTHFR基因型的分布差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。卒中组MTHFR野生型基因分布低于对照组，纯合突变型基因分布高于对照组（P＜0.01），T等位基因频率高于对照组（P＜0.01），见表2。

图1 MTHFR基因分型生物芯片识别图

表1 MTHFR基因型在不同性别脑卒中患者中的分布[n(%)]

表2 MTHFR基因型及等位基因的分布频率[n(%)]

3 讨论

MTHFR是Hcy代谢过程中最重要的催化酶，参与催化亚甲基四氢叶酸还原为N-5-甲基四氢叶酸，从而为Hcy代谢提供甲基。因此，MTHFR具有防止细胞内Hcy积聚、避免血浆中Hcy水平升高的作用。人类MTHFR基因最常见的多态性为677位点的胞嘧啶（C）被胸腺嘧啶（T）所取代，即C677T。677位点主要编码MTHFR与叶酸结合部位的结构蛋白，具有C677T多态性的MTHFR与叶酸结合能力下降，酶活性降低，导致血浆Hcy水平升高，增加血栓形成风险。目前，国外相关研究表明MTHFR基因C677T点突变是血栓性疾病的遗传性风险因素之一[7,8]。

本研究结果显示，武汉地区缺血性脑卒中患者中，不同性别患者MTHFR基因的多态性分布差异无统计学意义（P＞0.05），这与其他地区的报道相似[9,10]，表明性别对MTHFR基因多态性的分布影响不显著。此外，本研究表明具有多态性的杂合型和纯合型占77.8%，这比相关文献报道的68%突变率要高[11]，本研究里杂合突变型略高于此报道的34.8%，纯合突变型与此报道的33.2%相近。本研究与这些报道的基因多态性分布不同的原因可能与研究例数不同、研究对象的选择标准不同及研究对象的遗传背景不同等有关，尚需进行更大样本的调查分析，才能取得更有价值的资料。

总之，MTHFR基因多态性在武汉地区脑卒中人群中分布比较普遍，这对于临床实践具有重要的指导意义。笔者认为尽早进行MTHFR基因多态性筛选，并对MTHFR杂合突变型或纯合突变型的人群早期采取VitB12、叶酸等干预[12-14]，以降低血Hcy水平，对预防缺血性脑卒中有一定价值。

[1]Almawi WY,Khan A,Al-Othman SS,et al.Case-control Study of methylenetetrahydrofolate reductase mutations and hyperhomocysteinemia and risk of stroke[J].J Stroke Cerebrovasc Dis,2009,18:407-408.

[2]Wiernicki I,Millo B,Safranow K,et al.MMP-9,homocysteine and CRP circulating levels are associated with intraluminal thrombusthickness of abdominal aortic aneurysms:new implication of the old biomarkers[J]. Dis Markers,2011,31:67-74.

[3]Xie R,Jia D,Gao C,et al.Homocysteine induces procoagulant activity of red blood cells via phosphatidylserine exposure and microparticles generation[J].AminoAcids,2014,46:1 997-2 004.

[4]曾宪卿,何俊.急性脑梗死患者血浆同型半胱氨酸及相关硫醇物、叶酸、维生素B12水平变化及相关性研究[J].神经损伤与功能重建,2013, 8:26-29.

[5]中华医学会神经病学分会,中华医学会神经病学分会脑血管病学组.中国急性缺血性脑卒中诊治指南[J].中华神经科杂志,2015,48:246-257.

[6]Ghodke-Puranik Y,Puranik AS,Shintre P,et al.Folate metabolic pathway single nucleotide polymorphisms:a predictive pharmacogenetic marker of methotrexate response in Indian(Asian)patients with rheumatoid arthritis[J].Pharmacogenomics,2015,16:2019-2034.

[7]Joachim E,Goldenberg NA,Bernard TJ,et al.The methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism(MTHFR c.677C>T)and elevated plasma homocysteine levels in a U.S.pediatric population with incident thromboembolism[J].Thromb Res,2013,132:170-174.

[8]Hultdin J,Van Guelpen B,Winkvist A,et al.Prospective study of first stroke in relation to plasma homocysteine and MTHFR 677C＞T and 1298A＞C genotypes and haplotypes-evidence for an association with hemorrhagic stroke[J].Clin Chem Lab Med,2011,49:1 555-1 562.

[9]柳华,邱亚,刘伟,等.亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与川东北人群缺血性脑卒中的关联[J].西部医学,2014,26:701-706.

[10]Romero-Sánchez C,Gómez-Gutierrez A,Gómez PE,et al.C677T (RS1801133)MTHFR gene polymorphism frequency in a colombian population[J].Colomb Med(Cali),2015,46:75-79.

[11]肖湘雪,白树风.MTHFR基因多态性与脑卒中的关系研究[J].中国实验诊断学,2012,16:1311-1313.

[12]Holmes MV,Newcombe P,Hubacek JA,et al.Effect modification by population dietary folate on the association between MTHFR genotype,homocysteine,and stroke risk:a meta-analysis of genetic studies and randomised trials[J].Lancet,2011,378:584-594.

[13]Tamura Y,Inoue A,Ijiri Y,et al.Short-and long-term treatment with folic acid suppresses thrombus formation in atherogenic mice in vivo[J]. Pathophysiology,2014,21:169-175.

[14]`陈忠云,高金颖,李婧,等.伴高同型半胱氨酸血症的缺血性脑卒中患者的危险因素研究[J].神经损伤与功能重建,2012,6:422-424.

（本文编辑：王晶）

Analysis of Polymorphism Distribution of MTHFR Gene in Ischemic Stroke Patients in Wuhan

HAN Rui-ling,LI Yan.
Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China

Objective:To analyze polymorphism distribution of methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR) gene in ischemic stroke patients in Wuhan.Methods:Total 167 cases of ischemic stroke patients were enrolled as stroke group,and 110 healthy cases were enrolled as control group.MTHFR genotypes were detected by the gene chip method,and for different genotypes of patients were divided into wild type(C677C),heterozygous type(C677T)and homozygous type(T677T).Results:In the stroke group,wild type accounted for 22.2%,heterozygous mutant type and homozygous mutant type accounted for 43.1%,34.7%,respectively.Compared with the control group,the wild type was significantly reduced while the homozygous mutant was significantly increased(P＜0.05).Different gender had no statistical significance in MTHFR genotype differences(P＞0.05).Conclusion:There are more homozygous mutant MTHFR genes in ischemic stroke patients in Wuhan area.

ischemic stroke;methylenetetrahydrafolate reductase;MTHFR gene;gene polymorphism

R741;R743

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.03.004

武汉大学人民医院检验科

武汉 430060

国家自然科学基金（No.81501427）

2016-01-14

李艳

yanlitf1120@163. com