载脂蛋白E基因多态性与阿尔茨海默病的相关性研究

刘建强，王晴，井超

载脂蛋白E基因多态性与阿尔茨海默病的相关性研究

刘建强，王晴，井超

目的：探讨载脂蛋白E（ApoE）的多态性与阿尔茨海默病（AD）的相关性。方法：选取老年AD患者75例为AD组，另选取同期体检的健康老年人86例为对照组，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法（PCR-RFLP）对2组的ApoE基因多态性进行鉴定，并分析其与AD患病的相关性。结果：AD组ε3/ε4基因型频率高于对照组，差异有统计学意义（χ2=4.27，P＜0.05），ε3/ε3是最常见的基因型；AD组ε4等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义（χ2=4.40，P＜0.05），ε3是最常见的等位基因。相关危险度分析显示，ApoE的三个等位基因中ApoE ε4基因与AD有相关性（RR=3.76，P＜0.05），Apo ε2和Apo ε3基因与AD无相关性（RR=0.64、0.32，P＞0.05）。ε4基因为1或2个的患者AD患病率更高（χ2=3.87、4.62，P＜0.05）。结论：ApoE ε 4基因是AD患病的重要危险因素。

载脂蛋白E；阿尔茨海默病；基因多态性；相关性

阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）是多发于高龄人群的一种中枢神经系统退行性疾病，严重影响患者的生存质量。目前的研究仅表明AD的发病与遗传因素有一定联系，但其具体病因尚无定论[1]。近年来，越来越多的研究显示AD患病可能与载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）有关。由于ApoE基因处于19号染色体，其本身具有多态性，故ApoE与AD的具体联系仍需分析[2]。为此，本研究比较AD患者与正常老年人的ApoE基因多态性，分析其与AD的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2015年5月我院收治的老年AD患者75例为AD组，均符合美国精神病学会制定的DSM-Ⅳ中有关AD的诊断标准，男31例，女44例；年龄66～82岁，平均（74.8±8.5）岁；排除因外伤、心脑血管疾病等所致痴呆。另选取同期来院体检的健康老年人86例为对照组，男35例，女51例；年龄65～84岁，平均（75.1±8.3）岁。所有受试者之间均不存在血缘关系。2组的年龄、性别等相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

采集受试者外周静脉血3 mL，并加入ACD液抗凝待检，而后通过常规酚/氯仿法提取基因组DNA。将基因组DNA作为模板，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）对ApoE多态性进行检测。引物由上海Invitrogen生物工程公司提供，引物序列：上游引物A为5’-ATGCCATGACCTGCAGAATT-3’，上游引物B为5’-ATGCCGATGACCTGCAGAATC-3’，上游引物C为5’-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3’,上游引物C为5’-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3’，上游引物D为5’-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3’，公共下游引物E为5’-GTTCAGTGATTGTCGCTGGGCA-3’。50 μL的PCR反应体系中，包含5 μL 10×缓冲液、1 μL乙酰胺、2.5 U Taq聚合酶、40 pmol引物P1、40 pmol引物P2、5 μL二甲亚砜、2.5 μL dNTP（2 mmol/L）、5 μL DNA。PCR反应条件为：95℃预变性4 min，之后依95℃ 1 min→65℃ 1 min→72℃5 min共进行35次循环[3]。扩增产物长度为169 bp，使用2%琼脂糖凝胶电泳确认扩增成功后（图1），加入限制性内切酶Hha I对扩增进行酶切，所得产物再通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，采用溴化乙锭染色成功后置于紫外透射反射仪中观察片段，并对ApoE基因进行分型[4]。

图1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果

1.3 统计学处理

采用SPSS18.0统计学软件分析数据，计数资料用率（%）表示，χ2检验，采用相对危险度（relative risk，RR）对ApoE等位基因与AD患病的相关性进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组ApoE基因型与等位基因多态性比较

2组ApoE基因型多态性相比，AD组ε3/ε4基因型频率高于对照组，差异有统计学意义（χ2=4.27，P＜ 0.05），ε3/ε3是最常见的基因型；等位基因多态性相比，AD组ε4等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义（χ2=4.40，P＜0.05），ε3是最常见的等位基因，见表1。

2.2 ApoE等位基因与AD的相关性

对照组和AD组中含ε4例数分别为13、31例，RR分析显示，ApoE的3个等位基因中ApoE ε4基因与AD相关（RR=3.76，P＜0.05），Apo ε2和Apo ε3基因与AD无相关性（RR=0.64、0.32，P＞0.05）。

2.3 ApoE ε4基因与AD患病率的相关性

全部受试者依据含ApoE ε4基因的个数，分为无ε 4基因组（n=144）、1个ε4基因组（n=13）和2个ε4基因组（n=4），分别发生AD 63例（43.8%）、9例（69.2%）、3例（75.0%），进一步分析ε4基因个数与AD患病的关系。结果显示，1个ε4基因组和2个ε4基因组的AD患病率更高（χ2=3.87、4.62，P＜0.05）。

3 讨论

AD是一种以智力衰退、认知障碍等为特征的异质性神经失调疾病，是导致老年人出现认知障碍的最主要原因。研究表明，影响AD患病的基因位点共4个，分别处于第1、14、19和21号染色体，但唯一得到证实的仅有ApoE基因[5]。ApoE是人体中重要的载脂蛋白，在脑中主要作为胆固醇的载体，参与机体组织修复、血浆脂蛋白代谢、神经系统传导等过程。ApoE基因处于第19号染色体长臂13区2带，包含有ε2、ε3和ε4三类等位基因，其中以ε3最为常见，而ε3/ε3则是最常见的一类基因型。为了进一步探明ApoE与AD患病间的关系，本研究着重比较AD患者与正常老年人的ApoE基因多态性[6]。

表1 2组ApoE基因型与等位基因多态性比较[n(%)]

相关研究曾对AD患者与健康者的ApoE基因资料进行回顾性分析，结果显示AD患者的ε4基因频率明显更高，提示其与AD可能存在相关性[7]。本研究发现，2组ApoE基因型多态性相比，AD组ε3/ε4基因型频率高于对照组，差异有统计学意义（χ2=4.27，P＜0.05），ε3/ε3是最常见的基因型；等位基因多态性相比，AD组ε4等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义（χ2=4.40，P＜0.05），ε3是最常见的等位基因。这一结果支持ApoE ε4基因与AD患病存在可能联系。有研究表明，AD的病理特征为神经细胞外存在淀粉样蛋白沉淀、神经细胞消失以及细胞内存在神经元纤维缠结，其中淀粉样蛋白沉淀的出现主要与脑内乙酰胆碱含量的下降有关[8,9]。结合相关文献，笔者分析ε4基因会对人淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）基因产生一定作用，通过影响APP基因的水解位点从而使淀粉样蛋白沉淀增加，导致乙酰胆碱含量的减少，促使AD发生[10,11]。

本研究还对ApoE ε4基因与AD患病间的相关性进行危险度分析，结果显示ApoEε4基因与AD相关（RR=3.76，P＜0.05），Apo ε2和Apo ε3基因与AD无相关性（RR=0.64、0.32，P＞0.05）。相关文献表明，ε2基因与ε4基因作用相反，前者对AD主要起保护作用，后者则增加了AD患病的可能。但也有研究发现，许多携带ε4基因，甚至基因型为纯合子的高龄老人到90岁仍未发生AD，这提示除ε4基因外也存在其他因素影响AD的发病。本研究还显示，ε4基因为1或2个的患者AD患病率更高（P＜0.05）。有报道称，发现AD的患病率与ε4基因的个数呈正相关，家族性的AD患者中随着ε4基因的个数增加，AD的患病率甚至可增至90%，这与本研究结果相似[12,13]。此外，某些学者还发现患者的年龄与AD的发病存在联系，携带ε4基因者在56～74岁时更有可能发生AD，其余年龄段发病则主要由其他因素决定，结论符合AD发病的多因素影响理论[14,15]。

综上所述，ApoE ε4基因是AD患病的重要危险因素，ε4基因个数的增加会提高AD的患病率。

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（本文编辑：王晶）

Correlation between Apolipoprotein E Gene Polymorphisms and Alzheimer’s Disease

LIU Jianqiang,WANG Qing,JIN Chao.
Department of Neurology,Central Hospital of Zibo,Shandong 255036,China

Objective:To explore the correlation between the polymorphisms of apolipoprotein E(ApoE)and alzheimer's disease(AD).Methods:Total 75 AD patients were enrolled as AD group,and 80 healthy old people were enrolled as control group.The polymorphisms of ApoE gene were identified with the method of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).Its correlation with AD was analyzed.Results:ε3/ε4 genotype frequency in the AD group was higher than that in the control group,with significant difference(χ2=4.27,P＜0.05).ε3/ε3 was the most common genotype.The frequency of ε4 alleles polymorphism in the AD group was higher than that in the control group,with significant difference(χ2=4.40,P＜0.05).ε3 alleles polymorphism was the most common.Related risk analysis showed that ε4 gene were associated with AD(RR= 3.76,P＜0.05),while ε3 and ε2 were not associated with AD(RR=0.64,0.32,P＞0.05).The prevalence of AD with one or two ε4 gene was higher(χ2=3.87,4.62,P＜0.05).Conclusion:ε4 gene of the ApoE is an important risk factor forAD.

apolipoprotein E;Alzheimer's disease;genetic polymorphism;correlation

R741;R741.02;R742

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.03.013

淄博市中心医院神经内科

山东 淄博 255036

2015-11-18

刘建强

liujqjianqiang@163. com