柴胡疏肝散对癫痫合并抑郁大鼠的行为学及海马齿状回神经发生的影响

杨萍，李亮，孙美珍

论著

柴胡疏肝散对癫痫合并抑郁大鼠的行为学及海马齿状回神经发生的影响

杨萍1，李亮2，孙美珍3

目的：探讨柴胡疏肝散（CHSGS）对慢性癫痫合并抑郁大鼠的行为学及海马齿状回神经发生的影响。方法：24只癫痫合并抑郁（锂-匹罗卡品诱导）大鼠随机分为模型组、氟西汀组和CHSGS组，每组8只，另设置正常对照组（n=8）。造模第21天后正常对照组予生理盐水10 mL/kg，氟西汀组每日灌服氟西汀（0.75 mg/kg）；CHSGS组每日灌服2.7 g生药/kg，连续1月。利用糖水消耗试验、旷场试验及免疫组织化学方法检测大鼠的行为学及海马齿状回神经发生改变。结果：与正常对照组比较，模型组、氟西汀组、CHSGS组的糖水消耗及行为学评分明显下降，海马齿状回新生神经元增加（<0.05）。氟西汀组、CHSGS组糖水消耗及行为学评分较模型组明显提高，海马齿状回新生神经元增加（<0.05）；氟西汀组、CHSGS组相比差异无统计学意义。结论：CHSGS能提高癫痫合并抑郁大鼠海马齿状回的神经发生，改善抑郁症状。

柴胡疏肝散；癫痫；抑郁；齿状回；神经发生

癫痫与抑郁共存目前被认为是神经精神病学现象[1]。研究发现，癫痫后抑郁发作可能与海马区神经发生有关[2]。笔者前期研究证实5羟色胺1A（5-hydroxytryptamine1A，5-HT1A） 受 体 激 动 剂8-OH-DPAT能提高海马区新生神经元生长[3]，但因5-HT1A受体激动剂临床应用的局限性及西药副作用等问题，使其在临床应用中受到限制。中医药具有毒副作用小等特点，使得中医药治疗癫痫合并抑郁越来越得到关注。本研究通过观察中药复方柴胡疏肝散（Chaihu-Shugan-San，CHSGS）对匹罗卡品诱导慢性癫痫大鼠合并抑郁模型的行为学及海马齿状回神经发生影响，探讨CHSGS是否通过改善海马神经发生来发挥抗抑郁作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和分组 成年雌性健康清洁级SD大鼠112只，体质量180～220 g，由湖南中医药大学实验动物中心提供；标准饲料喂养，自由摄食饮水。随机选取8只为正常对照组，另104只制备癫痫模型；从成功的癫痫模型大鼠中通过糖水消耗试验及旷场实验行为学选取评分较低的大鼠，并与正常对照组相比有统计学意义的大鼠24只，随机分为模型组、氟西汀组、CHSGS组，每组8只。

1.1.2 药物与试剂 匹罗卡品（购于美国ABCR公司）；氯化锂、BrdU（购于美国Sigma公司）；小鼠抗BrdU单克隆抗体（BM0201）、山羊抗小鼠 IgG-TRITC（SA1021）（购于武汉博士德公司）；CHSGS（由湖南省中医药大学附属第一医院提供）。

1.2 方法

1.2.1 癫痫模型制备 腹腔注射氯化锂3 mEq/kg（1 mEq/kg=2 mmol/kg），18 h后再给予匹罗卡品30 mg/kg，在注射匹罗卡品前20 min注射阿托品l mg/kg以拮抗外周胆碱能作用。对照组注射30 mg/kg生理盐水。根据Racine分级标准[4]，造模后出现癫痫持续状态（status epilepticus，SE）40 min即给予地西泮4 mg/kg和10%水合氯醛3 mL/kg，终止发作；Racine分级≥Ⅳ级并存活者入组。

1.2.2 癫痫合并抑郁模型大鼠的筛选 于制模后第21天进行。①糖水消耗试验：造模前训练大鼠适应饮糖水，每笼同时放置2个水瓶，第一个24 h，两瓶均装有1%蔗糖水，随后的24 h，一个瓶装1%蔗糖水，另一个瓶装纯水。禁水24 h后，进行动物的基础糖水/纯水消耗试验。同时给予每只大鼠事先定量好的两瓶水：一瓶1%蔗糖水和一瓶纯水。1 h后，取两瓶水称量。计算动物的糖水消耗、糖水偏爱（糖水偏爱=糖水消耗/总液体消耗×l00%）；②旷场试验：由不透明材料制成的76 cm× 76 cm×42 cm正方形敞箱，底面等分为25个等边方格；晨7:30～12:00在安静的房间内观察置于中心方格内的大鼠5 min内垂直运动次数、水平运动次数。彻底清洁敞箱后进行下一只大鼠的观察。药物干预后1月再次进行上述指标的观察。

1.2.3 干预方法 制模后各组每日自由饮水、进食；造模第21天后正常对照组予生理盐水10 mL/kg；氟西汀组每日8:00灌服氟西汀（0.75 mg/kg）；CHSGS组每日8:00灌服2.7 g生药/kg，连续1月。

1.2.4 药物干预作用的评估 药物干预1月后给予各组大鼠观察药物干预对糖水消耗及旷场试验的影响。

1.2.5 BrdU免疫单标记法给药方式及免疫单标记法 参考文献[5]，Brdu细胞计数：400倍光镜下观察大鼠齿状回颗粒细胞层（granule cell layer，GCL）、颗粒下层增生带（subgranular zone，SGZ，GCL边缘与门区之间约2个细胞体厚的区域）Brdu阳性细胞数，每只大鼠随机选取8个非连续的脑片进行记数，得出每张切片的平均值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 癫痫模型制备结果

造模后10只大鼠死亡；造模成功94只，Racine分级为Ⅰ级3只、Ⅱ级2只、Ⅲ级3只、Ⅳ级18只、Ⅴ级68只。

2.2 癫痫合并抑郁模型大鼠的筛选结果

造模后第21天，根据糖水消耗、旷场试验筛选出24只癫痫合并抑郁模型大鼠，其糖水消耗为（8.96±2.80）mL、糖水偏爱为（58.92±10.30）%、垂直运动次数为（7.56±3.30）次、水平运动次数为（16.89± 6.40）次，较正常对照组的糖水消耗、糖水偏爱、垂直运动次数、水平运动次数分别为（13.61±2.70）mL、（83.56±7.50）%、（21.56±2.12）次、（58.16±13.12）次，前者较后者明显降低（<0.05）。将此24只大鼠随机分为模型组、氟西汀组和CHSGS组。

2.3 干预1月后各组大鼠抑郁指标比较

与模型组比较，氟西汀组、CHSGS组大鼠的糖水消耗、糖水偏爱、垂直及水平运动次数明显提高（<0.05）；与正常对照组比较，模型组上述指标明显降低（< 0.05）；氟西汀组与CHSGS组比较差异无统计学意义，见表1。

表1 干预后各组大鼠糖水消耗、行为学评分的比较（±s）

表1 干预后各组大鼠糖水消耗、行为学评分的比较（±s）

注：与正常对照组比较，①<0.05；与模型组比较，②<0.05

正常对照组 8 14.68±2.50 84.85±9.50 22.55±2.50 58.87±11.40模型组 8 7.65±2.80① 55.12±13.70① 7.40±2.30① 19.47±6.20①氟西汀组 8 13.56±2.30② 82.13±10.20② 12.58±4.50② 53.13±8.10②CHSGS组 8 13.88±1.80② 81.55±11.10② 14.66±3.80② 52.50±9.80②

2.4 干预1月后各组大鼠海马齿状回新生神经元的比较

正常对照组、模型组及氟西汀组、CHSGS组海马齿状回新生神经元分别为（2.13±1.10）、（35.23±5.60）、（62.56± 13.20）、（65.13±12.30）个，与正常对照组比较，模型组、氟西汀组、CHSGS组海马齿状回新生神经元显著增加（<0.05）；与模型组比较，氟西汀组、CHSGS组海马齿状回新生神经元显著增加（<0.05）；氟西汀组与CHSGS组比较差异无统计学意义，见图1。

图1 4组大鼠海马齿状回BrdU标记细胞（BrdU染色，×400）

3 讨论

癫痫是一种由脑部神经元高度同步化且常具有自限性的异常放电所导致的综合症。在我国，癫痫的患病率为3.6‰～7.0‰[6]，2010年活动性癫痫患者数量已达900多万，而且每年以40万的数量递增。癫痫反复发作，治疗时间长，严重影响患者的生活质量，同时给患者心理带来不同程度的影响。许多患者存在明显的心理、行为障碍。最近的一项Meta分析显示[7]，癫痫伴发抑郁的发生率为23.1%，明显高于普通人群的抑郁发生率，且抑郁的终身患病率达到13%。由此可见，癫痫与抑郁共病现象非常普遍。

虽然许多治疗对无神经系统疾病的抑郁有效，但是由于癫痫患者发生抑郁的机制尚不明确，这些疗法对癫痫患者抑郁的有效性可能受到限制。有研究显示，5-HT1A受体及神经可塑性均与癫痫合并抑郁的发病机制密切相关[8]。近年来神经干细胞研究发现成年灵长类和成人齿状回和侧脑室下区存在神经发生[9]。资料显示5-HT1A受体可能通过提高海马区神经可塑性改善癫痫抑郁症状[10]。Santarelli等[11]认为慢性使用抗抑郁药物通过5-HTRlA介导神经元再生可能是SSRI类药物的治疗机制。因此笔者前期使用5-HT1A受体激动剂8-OH-DPAT对锂-匹罗卡品诱导的癫痫合并抑郁复合大鼠模型进行干预，发现能够改善癫痫合并抑郁大鼠模型的抑郁行为，提高海马区新生神经元生长等[12]。

虽然笔者发现5-HT1A受体激动能改善癫痫合并抑郁大鼠模型抑郁程度，但在临床应用中仍受到限制，可能是因为5-HT1A受体激动剂坦度螺酮临床上多作为抗抑郁药物增效剂使用[13]及目前的抗抑郁药物（西药）均有不同程度的毒副作用、成瘾性及禁忌症等缺陷。甚至某些抗抑郁药会引起癫痫发作，例如三环类抗抑郁药、安非他酮、氟西汀等[14]。中医药具有调节靶点多、毒副作用小、药源广泛等特点，是否在癫痫合并抑郁治疗上具有优势是本研究关注的焦点。现代药理学研究表明CHSGS治疗癫痫及抑郁症具有良好效果。CHSGS可促进海马、杏仁核及额叶脑源性神经营养因子及其受体酪氨酸受体激酶B水平升高[15]，上调海马组织ERK1/2 mRNA的表达[16]，进而改善抑郁大鼠模型的抑郁症状。CHSGS还能下调大鼠海马及额叶皮质bax表达并上调bcl-2表达，抑制癫痫大鼠神经细胞凋亡[17]，从而起到良好的抗癫痫作用。因此本研究使用中药复方CHSGS对锂-匹罗卡品诱导的癫痫合并抑郁复合大鼠模型进行干预，并与氟西汀组进行比较，发现CHSGS组抑郁行为学指标及新生神经元数目与氟西汀组比较差异无统计学意义，但与模型组相比差异有统计学意义，这说明CHSGS可以调节癫痫合并抑郁大鼠海马齿状回神经发生并改善抑郁症状。

本研究结果表明CHSGS可能是通过增加海马齿状回的神经发生来改善抑郁症状，因样本量不足，实验未设置中药低高剂量组以及研究对它们之间是否通过5-HT1A受体起作用，需进一步探讨。

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（本文编辑：王晶）

Effects of Chaihu-Shugan-San on Behavior and Neurogenesis of Hippocampal Dentate Gyrus

in Epileptic Rats with Depression

Chaihu-Shugan-San;epilepsy;depression;dentate gyrus;neurogenesis

R741;R749.05;R742.1

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.04.011AbstractObjective:To explore the effects of Chaihu-Shugan-San (CHSGS)on behavior and neurogenesis of the hippocampal dentate gyrus in chronic epileptic rats with depression.Methods:Twenty-four rats with depression which were selected from the chronic pilocarpine-induced epileptic rats were randomly divided into 3 groups(8 in each):the groups of model,Fluoxetine and CHSGS treatment.And the normal control group was established(n=8).After 21 d of pilocarpine-induced epilepsy in rats,the model group received saline(10 mL/kg), the Fluoxetine group was given Fluoxetine(0.75 mg/kg),and the CHSGS group was given CHSGS(2.7 g/kg)for 1 month.Saccharose water consumption test,open-field test and immunohistochemistry were used to observe the behavior and neurogenesis in the hippocampal dentate gyrus.Results:when compared with those in the normal control group,the consumption of saccharose water and behavioral scores were significantly decreased whereas the number of newborn neurons in the hippocampal dentate gyrus were increased in the other three groups(< 0.05).The consumption of saccharose water,behavioral scores and numbers of newborn neurons in the hippocampal dentate gyrus were increased remarkably in the fluoxetine group and CHSGS group than than those in the model group (<0.05).There were no significant differences between the fluoxetine group and CHSGS group.Conclusion:CHSGS can increase the neurogenesis of the hippocampal dentate gyrus in epileptic rats with depression and effectively improve behavior recovery.

1.湖南省脑科医院精神科长沙 410007；2.湖南中医药大学中医诊断研究所长沙 410208；3.山西医科大学附一医院神经内科太原 030001

山西省归国人员基金（2008-52）

2014-03-18

李亮superliliang@126. com