应用马铃薯病原菌芯片法检测马铃薯主要病毒试验及结果分析

逯春杏，曹春梅*，王晓娇，许 飞，邢晓东，张志成

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古呼和浩特 010031；2.内蒙古自治区农畜产品质量安全中心，内蒙古呼和浩特 010010；3.乌兰察布市农林科学研究所，内蒙古乌兰察布 012000）

0 引言

马铃薯（Solanum tuberosum L.）属于一年生茄科茄属作物，一直以来在全世界的国家广泛种植。2016年2月23日，我国农业农村部正式发布《关于推进马铃薯产业开发的指导意见》，意见指出将马铃薯作为主粮产品进行产业化开发，使得马铃薯成了继稻米、小麦、玉米外的第四大主粮产业。近几年来，我国的马铃薯产业发展速度越来越快，种植范围越来越广，但经济收入却不可观。当前在马铃薯作物上发现的病毒、类病毒已多达40余种[1]，是马铃薯产量减少、品质下降、经济收入低的重要因素。为了解决这一问题，需研究出一个高效快捷、灵敏度高、完整的、规范化的检测技术体系。

传统方法是根据病毒在寄主体内寄生后的生物学特性来鉴别，但随着分子生物学的发展，现在多采用病毒的核酸、病毒蛋白的分子生物学鉴别方法，来提高病毒鉴定的准确性[2]。基因芯片以其高通量、高信息量且自动化程度高的特点成为检测病毒核酸的最佳方法之一。生物芯片属于分子生物检测层级，拥有优越的灵敏度，它是利用检体所提取出来的核酸RNA，经由核酸扩增仪（PCR）将其生物讯号放大到230倍，再利用专一性探针进行结合侦测，其灵敏度比传统检测方法（ELISA或是RT-PCR）高。其检测样本可选择马铃薯组培组织、薯块或叶片。

通常，在种薯生产上检测的病毒包括[3]：马铃薯Y病毒（potato virus Y，PVY）、马铃薯卷叶病毒（potato leaf roll virus，PLRV）、马铃薯M病毒（potato virus M，PVM）、马铃薯S病毒（potato virus S，PVS）、马铃薯A病毒（potato virus A，PVA）、马铃薯X病毒（potato virus X，PVX）和马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）[4]。利用马铃薯病原菌芯片法不仅可以在简短的时间内检测出是否含有上述病毒病，还可以同时检测PVY-N Type病毒、PMTV病毒以及4种细菌，即细菌性软腐病（Ech）、软腐黑胫（Pca、Pcc）、细菌性环腐（CMS）和细菌性青枯（RS），共计14种病毒病。该方法能有效避免因ELISA检测中病毒空窗期所产生的漏检之情形，准确把握马铃薯种薯质量，避免因遭受病毒或细菌感染造成的损失。

本研究利用马铃薯病原菌芯片检测技术对内蒙古自治区农牧业科学院马铃薯研究中心保存的试管苗进行病毒检测。研究结果可为马铃薯脱毒种薯生产过程中病毒检测及防治提供理论依据，提高马铃薯病毒检测水平，完善病毒检测体系。

1 基本原理

检测试剂适合各种检测样品，包含马铃薯组培苗、马铃薯块茎与植株叶片等。针对马铃薯病毒中的核酸进行分子生物检测，包括病原菌核酸提取（DNA/RNA Extraction）、核酸反转录聚合酵素连锁反应（Reverse Transcription Polymerase China Reaction）以及核酸杂合反应（Hybridization），同时使用非放射性之化学呈色方法进行显色。

2 特点

检测灵敏度比传统检测方法（ELISA或RT-PCR）高效、快捷。但需要注意环境与仪器的清洁，防止试验交叉感染。

3 材料与方法

3.1 试验材料

材料来源于内蒙古自治区农牧业科学院马铃薯研究中心试验室所保存的试管苗共计40份。

3.2 主要仪器和试剂

主要仪器包括杂合反应仪、震荡混合机、PCR仪、影像扫描分析仪（选用）、离心机、洗板机（选用）、-18℃冷冻冰盒和移液枪。主要试剂：病原菌核酸提取试剂包括Rapid EB Ⅰ和Rapid EB Ⅱ。RT PCR试剂组包括：PVB-IV、Taq和RT。杂合反应试剂组包括：HA Buffer、B Buffer、Strep-AP、NBT/BCIP、C Buffer、Wash Buffer、Gene Top PVB-IV芯片、96孔盘胶膜和研磨袋。此试剂盒由巨合生物科技股份有限公司提供。试验耗材（不包含在试剂盒中）：1.5 ml RNase-free离心管、抛弃式RNase-free吸管尖和RNasefree PCR操作管。

3.3 试验方法

3.3.1 病原菌核酸的快速提取

取0.35 g马铃薯组织，加入EBI试剂500 μl，将组织用小锤充分研磨。取100 μl该组织液到0.2ml PCR操作管中。将样品于PCR仪器中99℃加热2 min，随后在85℃下加热13 min，最后保存于4℃。用小型离心机快速离心30 s，小心吸取10 μl上清液加入预先装有240 μl EBII试剂的1.5 ml微量离心管中。利用试管震荡机将液体混合均匀，再用离心机离心数秒，此时管中的液体即为检测用的RNA样品。

3.3.2 RT-PCT反应

按照样品测定的数量来配制RT-PCR混合试剂，配制方法（表1）。将表中3种试剂利用震荡机混合均匀，吸取10 μl分装到各自PCR操作管中，最后在各PCR管中加入2 μl的样品核酸。将装好的所有PCR管放入PCR仪中，进行扩增处理。程序设置如下：a.45℃（30 min），94℃（2 min）；b.94℃（15 s），58℃（40 s），72℃（40 s），此过程循环30次；c.72℃（7min），8℃（∞）。

表1 RT-PCR混合试剂配制表

3.3.3 杂合反应

将RT-PCR产物在PCR反应仪中95℃加热210 s，等反应仪降温至4℃后，取出PCR管并置于冷冻保温盒中备用。离心数秒，取HA Buffer 100 μl到生物芯片中，加入RT-PCR产物10 μl，最后贴上胶膜。将生物芯片盘放入杂合反应仪中，55℃，1000 rpm反应30 min。反应后，倒掉杂合反应液，加入200 μl Wash Buffer清洗2次，最后静置1 min。倒掉Wash Buffer，并于吸水纸拍干。同时配制Blocking Reagent（表2）与Detection Reagent（表3），二者混合均匀将Detection Reagent避光存放，备用。

表2 Blocking Reagent配制表

表3 Detection Reagent配制表

取Blocking Reagent混合液100 μl加入生物芯片中。将生物芯片盘放入杂合反应仪中，55℃，1000 rpm反应5 min。反应后，倒掉反应液，用Wash Buffer 200 μl清洗1次，再次倒掉Wash Buffe。加入100μl C Buffer湿润生物芯片，静置1 min后倒掉并用吸水纸拍干。取Detection Reagent呈色混合液100 μl加入生物芯片盘中反应。随后将反应盘放入杂合反应仪中，55℃，0 rpm反应7 min。反应完毕后，倒掉反应液，并用自来水大量冲洗反应盘。冲洗完毕后，在55℃条件下干燥，并且判读结果。

4）生物芯片结果判读。根据展示，进行直观的结果判定（图1）。

图1 生物芯片结果判定对照

4 结果与分析

通过对40个马铃薯组培苗进行病原菌芯片检测，结果显示（表4、图2），在40份样品中，9份样品为复合侵染，7份为单独侵染，24份未检测到病毒侵染。其中，2份样品为PVY、PVS和PLRV的复合侵染，3份样品为PVY和PLRV的复合侵染，1份样品为PVM和PLRV的复合侵染，1份样品为PVM、PVS的复合侵染，1份样品为PVS和PLRV的复合侵染，1份样品为PVS和PSTVd的复合侵染。7份单独侵染的样品中，1份样品为PSTVd侵染，3份样品为PLRV侵染，1份样品为PVM侵染，1份样品为PVY侵染，1份样品为PVS侵染。

图2 部分样品检测结果判读

表4 马铃薯病毒检测结果

表4 马铃薯病毒检测结果（续表）

由此可见，无论复合侵染还是单独侵染，马铃薯PLRV病毒侵染率较高。PVA、PVX、Ech、CMS、RS和PCS均未检测到，说明PLRV可能是引起内蒙古地区马铃薯病毒病的主要病原之一，并且在马铃薯脱毒工作中较难脱除干净。

5 结论

由于病毒的侵染，马铃薯通过块茎无性繁殖并逐代增殖和加重是其退化的真正原因，同时也影响了马铃薯的产量与品质。因此，建立快捷高效的病毒检测体系，加大对种薯质量把关的力度，真正实现种薯的全面脱毒，是提高种薯产量、发挥优良品种特性的重要手段之一[5]。

马铃薯病毒检测技术主要有传统生物学检测技术、免疫学检测技术和分子生物学检测技术等。使用ELISA检测[6]方法耗时较长，不能一次性检测出两种或两种以上病毒复合侵染的样品，每一种病毒都需要独立检测，判定结果时会出现临界值存在的缺陷，造成检测结果存在一定偏差。近年来，随着科技的发展，以病毒核酸为研究的分子检测技术RT-PCR[7-8]更为灵敏、具有特异性，但检测费用高，仪器需求严格，操作过程复杂，且部分药品对人体有致癌的危害性，对操作人员的专业技术要求较高。

使用马铃薯病原菌芯片检测方法，大大缩短了检测时间，提高了工作效率与准确性。一般40个样品，24 h就可以轻松出结果，且结果同时包含常规6种病毒、1种类病毒和4种细菌性病毒。虽然购买试剂盒和仪器一次性投入费用高，但利于检测后工作的长期开展。简单培训相关技术人员即可上手检测，程序简化，判定结果一目了然，不存在处于临界值的判定缺陷。只需1间试验室分成4个不同模式的操作台，避免各试验步骤间相互交叉感染即可。试剂盒中所用的药剂均为安全药品，不会危及人体的健康。从种薯病毒检测源头抓起，定期抽检种薯生产企业，督促各龙头企业及种植户自检自查，提高种薯产量，提升马铃薯品质，形成一个良性循环的马铃薯种薯质量体系，从而增加经济收入，促进马铃薯产业绿色可持续发展。