穿膜肽钴原卟啉药物复合体对人晶状体上皮细胞的保护作用实验

刘雅婷，马天驹，叶 子，李朝辉

解放军总医院第三医学中心 眼科医学部，北京 100853

在世界范围内，年龄相关性白内障(age-related cataract，ARC)是患病率最高的致盲性眼病，全球50岁以上的人群中有9%的患者因为白内障而丧失视力[1]。因此研究能够抑制白内障形成并减缓其发展的药物具有重要的临床价值。ARC的发病机制目前尚不明确，但氧化应激介导的晶状体上皮细胞 (human lens epithelial cells，LECs)凋亡与其发生发展密切相关[2]。血红素氧合酶1(heme oxygenase-1，HO-1)是体内分布最广泛的抗氧化酶之一，已有研究证明其在细胞的氧化应激损伤过程中有重要的保护作用[3-4]。本课题组前期研究发现HO-1激活剂钴原卟啉(cobalt protoporphyrin，CoPP)可以通过下调活性氧，上调还原性谷胱甘肽和超氧化物歧化酶等抗氧化应激酶的含量，抑制H2O2诱导的人LECs凋亡[5]。但一些大分子药物很难通过局部滴眼液或口服药物在眼内达到适宜治疗浓度[6]。细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是一类不需要依赖受体，可以直接穿过细胞膜的多肽[7]。这类多肽可以携带生物活性物质进入细胞和组织，其低毒性和多组织普适性使之成为优良的药物载体[8]。有文献报道使用穿膜肽联合雷珠单抗局部滴眼给药作为玻璃体注药的替代疗法治疗脉络膜新生血管[9]。因此我们选用CoPP作为本研究中穿膜肽携带的药物。利用人晶状体上皮细胞系(SRA01/04)检测穿膜肽药物复合体R6-CoPP细胞膜穿透效果和对细胞活性的影响，并比较R6-CoPP与单纯CoPP对LECs氧化损伤的保护作用。期望能够为ARC的药物治疗研究提供新的方法和思路。

材料与方法

1 主要试剂和设备 钴原卟啉 (CoPP，CAS：102601-60-5，美国Sigma公司)、Fmoc-氨基酸、2-氯三苯甲基氯树脂 (2-chlorotrityl chloride resin，CAS：934816-82-7)、2-(1H-苯并三唑)-1,1,3,3-四甲基硫脲六氟磷酸盐(HBTU)、二氯甲烷、二异丙基乙胺(DIEA)、哌啶、二甲基甲酰胺(DMF)、异硫氰酸荧光素(5-Fitc)、三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷、1,2-乙二硫醇(上海强耀生物科技有限公司)；半自动多肽合成仪(上海岐昱实业)；高效液相色谱仪(HPLC，美国安捷伦公司)；质谱分析仪(MS，日本岛津公司)；纳米粒度及Zeta电位分析仪(美国Malvern公司)；冻干机(德国Christ公司)；共聚焦荧光显微镜、倒置荧光显微镜(德国Laica公司)；流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；酶标仪ELX800(美国BioTeK公司)；DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)高糖培养基、胎牛血清 (fetal bovine serum，FBS)、青霉素-链霉素溶液(双抗)(美国Gibco公司)；CCK-8试剂盒(日本株式会社同仁化学研究所)；含DNA结合染料Dapi甘油封片剂(北京索莱宝科技有限公司)等。其余试剂均为分析纯。

2 R6-CoPP 的制备和表征检验 参考 Cogan 等[9]的实验方法选择阳离子穿膜肽中穿膜能力较强的寡聚精氨酸R6(RRRRRR)，添加赖氨酸(K)稳定产物结构，利用脱水缩合的原理将其与CoPP连接，最后添加FITC荧光标记，序列为CoPP-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Lys(5-FITC)。使用9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，Fmoc)固相合成法合成R6-CoPP，产物的合成及纯化由上海强耀生物科技有限公司协助。简述步骤如下：将树脂溶胀后加入Fmoc-Lys(Dde)-OH作为首位氨基酸，甲醇溶液封尾，20%哌啶DMF溶液脱保护后使用HBTU和DIEA作为缩合剂，DMF作为活化剂，按照从Lys到Arg的顺序依次连接序列中的氨基酸，直至最后连接CoPP，使CoPP的羧基随机与Arg残基中的氨基进行缩合反应，去掉Lys侧链保护后加入5-FITC连接。切割液切割后用乙醚析出干燥后得到粗产物，利用反相色谱制备系统提纯。最后使用HPLC分析仪和质谱仪(MS)检测并计算纯化后产物的纯度和相对分子质量。高效液相色谱参数：Kromasil 100-5C18，30℃，流动相A为0.1% TFA + 乙腈，流动相B为0.1%TFA + 纯水，梯度流速 1.0 mL/min，检测波长220 nm。质谱参数：电喷雾 (ESI)，电压 4.5 kV±，雾化器(NEB)12.0，帘气(CUR)6.0。冻干产物加入去离子纯水制备成澄清溶液，稀释后用激光纳米粒度测量仪和Zeta表面电位测量仪对产物进行检测。滴加R6-CoPP溶液于铜网支持膜上，干燥后采用透射电镜进行成像。利用扫描透射高角环形暗场 (high angle annular dark field，STEM-HAADF)成像技术进行EDS面扫和线扫[10]。观测穿膜肽复合物的粒子形貌和钴元素分布表征。

3 细胞培养 SRA01/04 人晶状体上皮细胞系

(LECs)购于广州赛库生物技术有限公司。LECs细胞培养使用含有10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM高糖培养基。培养箱设置为37℃、5% CO2。细胞复苏后每日镜下观察细胞形态，融合达到80%左右时按1∶3进行传代。传代3 ~ 5次后，取对数生长期的细胞进行试验。

4 R6-CoPP 的细胞毒性检测 以 3 × 103/孔的细胞密度将LECs接种于96孔板，在培养箱中培养过夜，使细胞贴壁舒展。将细胞分为对照组和R6-CoPP处理组，对照组不加入药物正常培养，R6-CoPP 组分别加入浓度为 20 µg/mL、40 µg/mL、80 µg/mL、100 µg/mL 的 R6-CoPP，每组 3 个复孔。培养24 h后PBS清洗细胞3次，将CCK-8与培养基按1∶10的比例混合为CCK-8工作液，每孔加入110 µL的工作液，置于培养箱内继续培养2 h后用酶标仪测量各孔在450 nm波长处的吸光度值。根据各组的吸光度值，以对照组为参照计算细胞存活率。细胞存活率在75% ~ 100%区间内说明材料的细胞毒性低，生物相容性良好。

5 细胞流式仪检测 R6-CoPP 的穿膜能力 以 3 ×104/孔的细胞密度将LECs接种于6孔板，培养箱培养过夜后分别更换浓度为 10 µg/mL、20 µg/mL、40 µg/mL 的 FITC 标记的 R6-CoPP 孵育 2 h，吸去培养基，PBS洗涤3次，0.25%胰蛋白酶消化、收集细胞，流式细胞仪上机分析荧光阳性细胞比例。

6 共聚焦显微镜观察 R6-CoPP 在细胞内的定位以 5 × 103/孔的细胞密度将 LECs 接种于 35 mm共聚焦培养皿中，在培养箱培养过夜，镜下检查细胞贴壁舒展后，更换R6-CoPP浓度为20 µg/mL的培养基孵育 0.25 h、3 h、6 h、24 h，以未加药培养的细胞作为对照组，PBS洗涤3次后每皿加入1 mL的4%多聚甲醛常温下固定细胞20 min。固定完成后PBS洗涤3次，每皿加入1 ~ 2滴含DNA结合染料DAPI的甘油封片剂，激光共聚焦显微镜观察拍照。

7 R6-CoPP 体外抗氧化应激损伤效果评价 以3 × 103/孔的细胞密度将LECs接种于96孔板，在培养箱中培养过夜，实验组分别加入H2O2浓度为200 µmol/L、400 µmol/L、600 µmol/L 的培养基培养24 h，对照组仅换液，每组3个复孔。培养结束后用CCK-8试剂盒检测各组细胞的存活率，选择存活率＜50%的浓度用于后续的实验。药物预处理细胞24 h后更换含有H2O2的培养基孵育24 h构建细胞氧化损伤模型[5,11]。细胞处理同前。将细胞随机分组：对照组，完全培养基培养48 h；H2O2氧化损伤模型组，完全培养基培养24 h后更换 H2O2浓度 600 µmol/L 的培养基培养 24 h；CoPP预处理组，CoPP浓度为10 µmol/L的培养基培养 24 h 后更换 H2O2浓度 600 µmol/L 的培养基培养24 h；R6-CoPP预处理组，R6-CoPP浓度为20 µg/mL 的培养基培养 24 h后更换H2O2浓度600 µmol/L 的培养基培养 24 h。培养结束后用CCK-8法检测各组吸光度并计算各组的细胞存活率。

8 统计学分析 使用 GraphPad Prism 8.0 进行统计学分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey 检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 高效液相色谱和质谱鉴定 R6-CoPP 根据HPLC色谱图计算得出合成的R6-CoPP主峰明显，纯度为94.56%，杂质较少，纯度较高。质谱分析结果计算后得出相对分子质量为2109.75，与预计分子量2109.82十分接近，见图1。纳米粒径和表面电位测量仪检测结果见图2，粒径227.8 nm，表面电位 + 13.9 mV。表面携带阳性电荷。透射电镜图像中可观察到结构疏松的R6-CoPP多肽颗粒(图3A)，X线能谱元素分布(EDS-Mapping)图像中可见代表钴元素的亮点分布在R6-CoPP中(图3B)，双峰X线断层扫描图可见钴元素曲线(图3C)。

图1 R6-CoPP高效液相色谱分析图和质谱分析图Fig.1 High-performance liquid chromatography and mass spectrometry of the cell-penetrating peptide drug complex (R6-CoPP)

图2 R6-CoPP的粒径和Zeta电位分布图Fig.2 Size distribution and Zeta potential distribution of R6-CoPP

2 R6-CoPP 对 LECs细胞活性的影响 使用不同浓度R6-CoPP处理LECs细胞，24 h后对照组以及 R6-CoPP浓度为 20 µg/mL、40 µg/mL、80 µg/mL、100 µg/mL 的细胞存活率分别为 100.01% ± 3.86%、97.99% ± 2.55%、91.02% ± 12.32%、86.47% ± 9.14%、62.09% ± 2.60%(F=13.17，P＜0.05)。小于 80 µg/mL浓度的处理组相比对照组细胞存活率虽然有降低趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)。浓度为100 µg/mL处理组细胞存活率小于75%(P＜0.05)。见图4。

3 的细胞膜穿透能力 流式结果显示，浓度为10 µg/mL、20 µg/mL、40 µg/mL 的 R6-CoPP 与细胞共培育2 h后均检测出了较强FITC荧光信号，荧光信号分别为82.33%±6.25%、89.53%±3.84%、95.80%±1.21%(F=399.4，P＜0.000 1，差异有统计学意义)。荧光阳性细胞比例随着浓度的升高递增，不同浓度的R6-CoPP处理组与对照组的荧光阳性细胞比例均有统计学差异(P＜0.05)。R6-CoPP浓度为40 µg/mL处理组的荧光阳性细胞比例大于浓度为 20 µg/mL 和 10 µg/mL 的 R6-CoPP处理组，差异有统计学意义(P＜0.05，图5)。荧光显微镜观察显示，孵育15 min后R6-CoPP已经大量进入细胞，荧光强度较高(图6)。图7中细胞3D图像中可见绿色荧光分布于整个细胞质，并不局限于细胞膜周围。细胞内的荧光强度随着孵育时间的增加而下降，24 h后几乎不可见。

图5 不同浓度R6-CoPP孵育2 h后荧光信号阳性细胞比例(aP＜0.05，vs 对照组；bP＜0.05，vs 10 µg/mL 组，cP＜0.05，vs 20 µg/mL 组；n=3)Fig.5 Fluorescence positive cell ratio in cells cultured with different concentrations of R6-CoPP for 2 h (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs 10 µg/mL group; cP＜0.05, vs 20 µg/mL group; n=3)

图6 R6-CoPP(20 µg/mL)与晶状体上皮细胞孵育不同时间后细胞内的荧光分布(40×，比例尺50 µm)Fig.6 Observation of green FITC fluorescence in LECs after cultured with R6-CoPP at different time points under a Confocal Fluorescence microscope (40×, scale bar=50 µm)

图7 共聚焦显微镜构建3D图像观察R6-CoPP(20 µg/mL)与细胞孵育不同时间后细胞内的荧光分布(40×)Fig.7 Observation of green FITC fluorescence in LECs after being cultured with R6-CoPP(20 µg/mL) at different time points in a 3D picture created by a Confocal Fluorescence microscope (40×)

4 R6-CoPP 体外抗氧化应激损伤效果 CCK-8 法检测显示，随着H2O2浓度的增加，细胞存活率均下降。H2O2浓度为0 µmol/L、200 µmol/L、400 µmol/L 和600 µmol/L 的细胞存活率分别为100.21% ± 14.30%、73.99% ± 2.12%、47.69% ± 4.10%、42.98% ± 10.69%(F=24.58，P＜0.0002)，差异有统计学意义)。当H2O2浓度＞400 µmol/L时细胞存活率＜50%，后续实验选择600 µmol/L的H2O2进行氧化损伤模型组造模(图8)。对照组、H2O2氧化损伤模型组、CoPP预处理组、R6-CoPP预处理组的细胞存活率分别为100.61% ± 1.34%、35.64% ± 2.25%、50.56% ± 1.37%、58.95% ± 1.25%(F=902.9，P＜0.0001，差异有统计学意义)。与H2O2氧化损伤模型组相比，R6-CoPP预处理组、CoPP预处理组的细胞存活率显著提高(P＜0.05)。与CoPP预处理组相比，R6-CoPP预处理组的细胞存活率更高(P＜0.05)。见图9。

图8 不同浓度的H2O2对LECs细胞活性的影响(aP＜0.05，vs 对照组；n=3)Fig.8 Effect of different concentrations of H2O2 on cell viability(aP＜0.05, vs control group; n=3)

图9 CoPP和R6-CoPP预处理对于H2O2诱导后细胞存活率的影响 (aP＜0.05，vs 对照组；bP＜0.05，vs 模型组；cP＜0.05，vs CoPP预处理组；n=3)Fig.9 Effect of CoPP and R6-CoPP pretreatment on cell viability of LECs treated with H2O2 (aP＜0.05, vs control group; bP＜0.05, vs H2O2 group; cP＜0.05, vs H2O2 + CoPP group; n=3)

讨 论

目前关于载药系统的研究多集中在脂质体和聚壳糖等高分子材料包载药物，通过延长滴眼液药物在角膜表面的停留时间来增强药物的穿透效果[12]，而穿膜肽作为载体利用其穿透特性构建眼部给药系统的研究较少。有许多研究表明穿膜肽的细胞毒性较低，其中阳离子富精氨酸穿膜肽还具有一定的神经保护作用[13]。穿膜肽可以通过共价结合或单纯结合的方式携带药物，提高药物进入细胞的能力。Zou等[14]报道利用穿膜肽携带药物通过血脑屏障治疗中枢神经疾病。在眼科领域，Gonzalez-Pizarro等[15]利用TAT修饰高分子聚合物纳米粒子(PEG-PLAG)携带氟米龙进入眼

内，在眼前节和眼后段发挥抗炎效果。

本实验中我们选择寡聚精氨酸R6作为药物载体，通过脱水缩合的方式将其与CoPP共价结合。经过质谱检测计算合成产物分子质量为2109.75，与预计分子量2109.82接近。而透射电镜和元素曲线分析进一步验证了钴元素与穿膜肽药物的同步

分布，表明药物与穿膜肽成功连接。运送载体表面的正电荷可以与携带负电荷的细胞膜相互吸引并结合，通过细胞内吞或融膜作用增加载体转入细胞的效率[7]。寡聚精氨酸是阳离子型穿膜肽，在生理的pH值环境中携带正电荷，R6-CoPP表面携带正电荷13.9 mV，略高于Gao等[16]研究中富精氨酸穿膜肽修饰的脂质体类药物的表面电位，考虑因为大部分脂质体类药物携带有较强的负电荷。虽然通过穿膜肽修饰可以降低或逆转脂质体类药物载体所带负电荷以提高药物的吸收率[16-17]，但载药脂质体的制作工艺更为复杂，且许多研究都是通过室温孵育，利用分子间的电荷吸引作用将大分子蛋白或载药脂质体与穿膜肽连接[9,18]，在连接的时候也会产生装载药物泄露的问题。本实验通过脱水缩合的方式在固相合成的过程中将CoPP上的羧基与穿膜肽游离的氨基连接，形成的酰胺键较为稳定，且可以通过检测合成产物的相对分子质量确保药物与穿膜肽连接。经细胞体外实验检测R6-CoPP在80 µg/mL浓度下对细胞活性无明显影响，且与Liu等[19]的聚精氨酸类穿膜肽修饰药物的生物安全浓度相近，生物相容性较好。流式细胞检测结果显示，在相同的孵育时间，R6-CoPP浓度越高，荧光阳性细胞比例越高，即摄入R6-CoPP的细胞越多，但Zuconelli等[20]的研究发现较高浓度的聚精氨酸类阳离子穿膜肽直接穿过细胞膜进入细胞时可能会导致细胞内钙离子含量的增加，而晶体内部由于代谢失衡导致的钙离子浓度升高也在白内障的形成中具有一定作用。因此我们选择较低浓度的20 µg/mL作为实验浓度。根据共聚焦荧光显微镜显示R6-CoPP可以被晶状体上皮细胞摄取，且均匀分布于细胞质，具有高效的细胞膜穿透能力。在利用H2O2模拟的LECs氧化损伤模型中，R6-CoPP表现出了与CoPP相近的减轻上皮细胞凋亡的作用。由于实验的局限性，只在细胞水平检测了药物的抗氧化损伤作用，并不能确定R6-CoPP是否能在体内实验中发挥出抗白内障、减缓白内障疾病进展的作用。需要进一步进行体内实验验证。

综上所述，本研究构建了一种穿膜肽药物复合体，细胞相容性较好，具有较强的细胞膜穿透能力，在体外实验中表现出了一定的抗氧化损伤作用，给未来的白内障预防和延缓其进展的药物研究提供一定的启发。