母胎界面外泌体的生理作用及其参与病理妊娠的研究进展

方 正，董 杰，王晓红

空军军医大学唐都医院 妇产科，陕西西安 710032

母胎界面是指蜕膜与胚胎外组织之间形成的结构，是孕期介导母体免疫系统对胎儿产生免疫耐受的重要结构。胎儿侧以滋养细胞为中心，在胎儿与底蜕膜之间形成胎盘，是面对母体免疫细胞的“第一道防线”[1]。母体侧主要是指底蜕膜，是子宫内膜经过一系列分子事件后蜕膜化形成的特殊类型的组织。母胎界面细胞间的通讯交流在妊娠的建立与维持过程中发挥重要作用。近年来我们更清楚地认识到，外泌体作为一种新型的细胞间通讯工具，参与维持整个孕期的母胎界面稳态，并且在病理妊娠中发生改变。本文对外泌体在母胎界面中生理作用与病理妊娠中改变的相关研究进展做一综述。

1 外泌体概述

1.1 外泌体的生物发生 外泌体是直径30 ～ 150 nm(平均直径100 nm)的具有磷脂双分子层膜结构的“茶杯状”囊泡，在细胞通讯中发挥重要作用[2-3]。几乎所有的真核细胞都会通过向外“出芽”的方式分泌外泌体[4]。首先，细胞膜内陷形成杯状结构，这一过程使得细胞膜外侧的液体和一些“货物”如蛋白质、脂类、代谢物、小分子、离子与细胞膜表面蛋白一同进入细胞，形成早期胞内体(early-sorting endosome，ESE)。ESE也可与细胞生物膜系统发生融合，装载细胞内货物。随后，ESE形成晚期内体、多泡小体和管腔内囊泡，同时伴随外泌体货物的进一步装载和自身修饰。最后，管腔内囊泡通过多泡小体锚定蛋白锚定于细胞膜内侧，释放出细胞，形成外泌体[5-6]。在外泌体发生过程中，需要多种蛋白协助，如内吞体分选转运复合体、多配体蛋白聚糖、凋亡连锁基因产物2相互作用蛋白X和肿瘤易感基因101等[2,7]。同时，由于细胞膜的参与，CD9、CD63、CD81和CD37等四次跨膜蛋白也表达于外泌体膜，对于外泌体的鉴定具有重要意义。

1.2 外泌体的内容物及其功能 外泌体的内容物包括DNA、RNA、脂质、代谢产物、蛋白质等[5,8]。不同细胞来源的外泌体可携带不同的“货物”，可以用于鉴定其细胞或组织的起源，如胎盘来源的外泌体特异性表达胎盘碱性磷酸酶(placental alkaline phosphatase，PLAP)[9]。值 得 注意的是，外泌体携带的“货物”与细胞本身内容物的含量并不平行[10]，并且同一细胞产生的外泌体也具有异质性[11-12]，这从侧面反映了外泌体是细胞经过选择后的产物。外泌体富集糖蛋白和跨膜蛋白，包括糖蛋白Ib、P选择素和整合素等，这可能与外泌体与细胞间通讯的黏附事件相关。除此之外，外泌体携带的核酸也在细胞通讯中发挥重要作用。外泌体携带长度19 ～ 6 000 nt的至少10种类型RNA。小RNA包括miRNA、tRNA、与PIWI蛋白作用RNA、核小RNA、核仁小RNA以及一些RNA碎片[13-14]。长链RNA包括长链非编码RNA、信使RNA、环状RNA[15]，这三者与miRNA构成内源竞争RNA调控网络。 miRNA在外泌体调控网络中处于核心地位。

2 外泌体在母胎界面中的作用

2.1 胚胎来源外泌体促进母胎界面建立免疫耐受和胚胎成功种植 胚胎来源的外泌体最早在牛、小鼠和猪的胚胎培养基中发现[16-17]，之后Giacomini等[18]又在人胚胎培养基中发现。胚胎来源的外泌体富含CD9、CD63和CD81外泌体标志蛋白。除此之外，胎盘来源外泌体具有合体滋养细胞特异性蛋白PLAP和滋养细胞特异性蛋白人白细胞抗原G(human leukocyte antigen G，HLA-G)[19-20]。在母体外周血中，通过上述两种蛋白可特异性地鉴定分离出胎盘来源外泌体，并且胎盘外泌体的量可用来预测胎儿生长情况，判断妊娠结局[21]。

辅助生殖技术过程中，Giacomini等[18]在第3天和第5天的人胚胎培养基中发现了含膜结合型和可溶型HLA-G的外泌体，并且在清除培养基中的外泌体后，HLA-G的含量低于检测下限。这一发现提示我们存在于培养基上清中的绝大多数HLA-G可能是以外泌体或囊泡形式与靶细胞互作的[18]。体外实验发现，人胚胎来源的外泌体可以被蜕膜内的上皮细胞和基质细胞摄取，重塑局部免疫环境。HLA-G诱导蜕膜髓系来源细胞向耐受性树突状细胞分化后，树突状细胞将HLA-G呈递给dNK和Mø。在孕早期，dNK含量可由未孕期的20%增长到40%，进入分泌期后，dNK含量可达到70% ～ 80%。与外周血中NK细胞表现出的杀伤作用不同，dNK主要表现为分泌各种细胞因子，如干扰素-γ、血管内皮生长因子、白细胞介素-8等。滋养细胞表达的HLA-C、HLA-E、HLAG与dNK表达的杀伤性免疫球蛋白样受体(killing immunoglobulin receptors，KIR)结 合，促 进dNK分泌促炎因子和血管生成因子，抑制dNK的细胞毒作用。HLA-G与dNK表面的KIR2DL4受体结合，促进dNK分泌生长因子和细胞因子，促进血管重塑和维持正常妊娠[22]。蜕膜巨噬细胞(decidual macrophages，dMø)占蜕膜免疫细胞的20% ～ 25%，是蜕膜内主要的抗原提呈细胞。HLA-G与dMø表面的免疫球蛋白转录子2作用，促进dMø向M2型极化，分泌IL-10、趋化因子CC基元配体2(chemokine C-C motif ligand 2，CCL2)和CCL18，表现出调节免疫和抗炎作用。Mø既可以促进螺旋动脉的重建和滋养细胞的侵袭，又可以通过分泌VEGF和基质金属蛋白酶9促进血管新生和蜕膜组织重构，辅助胚胎成功种植。

研究表明，将胚胎来源的外泌体添加到胚胎培养基中，可以挽救囊胚形成率，提高胚胎质量，促进胚胎后续的生长发育；在小鼠实验中，胚胎来源外泌体处理过的胚胎可以提高植入率，增强植入能力[23]。

2.2 母体来源的外泌体促进胚胎着床 母体在整个胚胎发育的过程都分泌外泌体促进胚胎发育。在受精卵发育的第一站——输卵管，外泌体就开始了对胚胎的支持[24]。在牛和小鼠的实验中，研究者发现输卵管来源的外泌体中存在多种与细胞代谢、免疫调控和细胞凋亡相关的蛋白。更重要的是，在输卵管液中存在胚胎营养因子，这提示我们输卵管参与早期胚胎发育。不仅如此，外泌体因其优越的穿透性和靶向递送功能，可成功穿越透明带并被胚胎摄取。研究显示，外泌体可影响小鼠胚胎卵裂率，促进胚胎细胞增殖，提高胚胎质量，并可延长胚胎体外存活时间[25]。

植入时，胚胎与母体的交流是双向的。除可溶性细胞因子外，母体蜕膜上皮细胞也分泌外泌体影响胚胎种植。在胚胎植入前，蜕膜上皮细胞外泌体可激活子宫内膜上皮细胞凋亡途径Bcl-2、Bax、Caspase-3和Tp53基因的表达；而胚胎植入后，外泌体主要上调子宫内膜上皮细胞黏附相关蛋白如Vcam1的表达，辅助胚胎着床后的进一步黏附[26]。除上皮细胞外，人蜕膜基质细胞的外泌体可以上调滋养细胞钙黏蛋白的表达进而促进侵袭功能[27]；并可以促进内皮细胞成管，可能在血管生成中发挥重要作用。蜕膜来源外泌体的以上作用，体现了蜕膜的容受性和着床中的旁分泌作用。

3 外泌体与病理妊娠

胚胎来源外泌体在病理妊娠中起重要作用。已有研究表明，在妊娠过程中，孕妇外周血中外泌体会大量增加，并且在孕妇外周血中鉴定出了含HLA-G与PLAP的外泌体，这说明孕妇外周血中含有胎盘来源外泌体[28]。在不同疾病中，孕妇外周血中外泌体携带的不同货物的组学分析已经证实其种类和数量的变化可能直接影响靶细胞的功能，导致不良妊娠结局[29-30]。

3.1 外泌体与子痫前期 子痫前期是妊娠期发病率和死亡率最高的疾病，发病率在所有孕妇为5% ～ 7%，每年可造成全世界7万孕妇和50万胎儿死亡，也是早产的重要病因之一[31]。但其发病原因尚不明确，有研究认为是胎盘浅着床导致胎盘低灌注，进而导致高血压和蛋白尿[32]。子痫前期患者与健康患者胎盘外泌体的组学分析发现，子痫前期患者外泌体中具有较高水平的磷脂酰丝氨酸和较低水平的磷脂酸、磷脂酰甘油、神经节苷脂甘露糖苷；并且合胞素2蛋白、基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9等功能蛋白表达量均下降[33-34]。上述蛋白的降低均可影响螺旋动脉的重塑，影响胎儿生长，导致胎盘浅着床和血流量下降，最终导致子痫的发生。在妊娠的前3个月，子痫前期患者血浆外泌体中特定的miRNA可能作为预测疾病的分子标志物。子痫前期患者血浆外泌体中高表达miR-1269[35]，其下调叉头盒子O1基因(forkhead box O1 gene，FOXO1)的表达，而FOXO1蛋白会影响胚胎着床，可能造成胎盘低灌注[36]；子痫前期患者外泌体中高表达的miR-525-5p[35]可抑制血管活性肠肽进而降低机体抗炎作用，这可能与子痫前期全身小动脉血管内皮炎症相关。除此之外，在孕晚期子痫前期患者血浆外泌体中，内皮一氧化氮合酶活性降低[37]，导致患者血管调节能力减弱。

3.2 外泌体与妊娠期糖尿病 妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠期首次发生糖耐量异常，发生率为13.0% ～ 20.9%，且呈逐年增高趋势[38]。GDM会导致胎儿处于高糖、高胰岛素和缺氧环境中，导致绒毛滋养细胞释放大量的外泌体[39-40]，并且这些外泌体表现为促炎作用[28]。有研究表明，GDM患者血浆中胎盘外泌体的浓度显著高于孕周匹配的正常妊娠女性，并且可能与胎儿的体质量呈正相关[41]；并且母胎界面局部外泌体的差异化miRNA表达也会体现在患者血浆外泌体中。GDM患者早孕期血浆外泌体差异化miRNA主要参与胰岛素和葡萄糖调节通路，包 括miR-122、miR-132、miR-136、miR-182、miR-210、miR-29和miR-342等[42]；在GDM诊断时(22 ～ 28周)的血浆外泌体中，主要表现为与胰岛素敏感度相关蛋白的差异表达，如钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶2β和妊娠相关血浆蛋白A[43]。GDM患者与正常体质量指数患者血浆外泌体相比，可增加内皮细胞促炎因子的释放；在小鼠体内实验中，血浆外泌体改变了骨骼肌miRNA表达谱和胰岛素相关通路[44]，提示我们GDM患者血浆外泌体在调节妊娠期葡萄糖稳态中具有重要作用。但考虑到部分GDM患者体质量指数较高，所以可能需要更多的纵向比较数据和母胎界面原位外泌体数据。

4 结语

大量的研究结果证实了母胎界面外泌体可以辅助胚胎种植和维持妊娠，并在妊娠期特有疾病中发生显著改变。前期的众多研究数据来源于非灵长类动物或细胞系，较少来源于人的原代组织。因此，如何提取可以更好反映细胞在体情况的外泌体，是我们需要解决的问题。在妊娠期特有疾病中，已经报道了孕妇外周血中胎盘来源外泌体的异常改变，但将其作为生物标志物用于临床检测仍需要更多的样本量来验证。同时，外泌体还可预测胚胎发育潜能，在可预见的未来，使用外泌体作为标志物进行临床检验，将是一个前景广阔的重要无创检测手段。