去线性泛素化酶OTULIN通过NF-κB通路调节炎症和细胞死亡的研究进展

范俊梅，张雪洛，陈艳花，张俊坤，毕星宇，王 军，武学清

1 山西省妇幼保健院，山西太原 030013；2 太钢总医院，山西太原 030000

泛素化是指泛素蛋白或泛素链通过共价键与蛋白质结合的过程，是真核生物蛋白翻译后修饰的重要方式。一种或几种泛素蛋白与底物结合后可以发挥多种细胞调节功能，如蛋白酶降解、细胞膜运输、DNA修复和信号转导等，表现为细胞存活和分化、炎症、免疫反应等多种生理活动。线性泛素化修饰是近年新发现的一种特殊类型的泛素化修饰方式。OTULIN是目前发现的可特异性降解线性泛素链的去泛素化酶，可通过核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路调节炎症和细胞死亡[1]。本文就OTULIN基于NF-κB通路调节炎症和细胞死亡的研究进展做一综述。

1 泛素和线性泛素化修饰

泛素由76个氨基酸组成，相对分子质量为8.5 kU，包含7个高度保守的赖氨酸(Lysine K)。泛素本身可以自泛素化，从而产生多聚泛素(Poly-Ub)链，特异性识别不同的底物蛋白[2]。泛素链内部赖氨酸残基与泛素分子C末端的甘氨酸G连接，根据连接方式不同，分为 K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63，产生不同的生理作用，其中K48和K63在NF-κB通路的激活中起重要作用[3]。泛素甲硫氨酸Met1的氨基与另一泛素甘氨酸的羧基相连，形成线性泛素链(linear ubiquitin/Met1-linked ubiquitin chains/Met1-Ub)，是一种特殊类型的泛素化修饰方式，在先天性免疫和抑制炎症反应等多种过程中发挥重要作用[4]。泛素化是泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3催化的酶级联反应。

2 OTULIN的分子结构

目前已知的特异性去线性泛素化酶包括OTULIN和CYLD。OTULIN，也称为Gumby/FAM105B，是脱泛素酶家族(deubiquitinases，DUBs)卵巢肿瘤相关蛋白酶亚族(ovarian tumor related proteases，OTUs)的成员，仅作用于Met1-Ub内部的连接点，对线性泛素化修饰蛋白的泛素化水平进行调节，而对未泛素化的蛋白无直接作用[3]。人类OTULIN编码基因位于染色体5p15.2，OTULIN蛋白由352个氨基酸组成，包含3个重要结构域：1)Met1-Ub结合域，是OTULIN和Met1-Ub链的连接区域，此结构突变会导致OTULIN对Met1-Ub的亲和力降低，从而降低OTULIN活性；2)Cys-His-Asn催化中心，该结构位于OTULIN蛋白的OTU结构域，由Asn341、His339和Cys129构成三级结构催化中心，且与OTULIN的活性构象密切相关，OTULIN催化结构域在物种间高度保守；3)N-末端类PIM结构，OTULIN可与HOIP的N-末端PUB结构域结合，故称为PIM(PUB-interaction motif)，该结构与HOIP的PUB结构域的结合具有特异性和高亲和力[1]。

3 OTULIN通过LUBAC和NF-κB通路调节炎症和细胞死亡

线性泛素链组装复合体(linear ubiquitin chain assembly complex，LUBAC)于2006年由Kazuhiro等首次提出，认为LUBAC由HOIL-1L和HOIP组成(也分别称为 RBCK1和RNF31)，2011年Tokunaga发现Sharpin也是LUBAC的组成部分之一，最终LUBAC被定义为包含Sharpin、HOIL-1L和HOIP的复合体。LUBAC是目前已知的唯一产生Met1-Ub的E3泛素连接酶，研究发现HOIP具有自抑制的功能，但与Sharpin、HOIL-1L结合，可以释放 HOIP 自抑制的活性[5]。

Met1-Ub通过NF-κB通路引起免疫反应或导致细胞死亡[1,6]，故LUBAC在调节免疫反应和抗细胞死亡方面发挥作用[7]。研究发现，Sharpin基因无义突变致小鼠出现慢性增生性皮炎，HOIL-1突变导致人类机体产生严重炎症，表明LUBAC在控制感染和炎症的发生中发挥关键作用[8]。HOIP是LUBAC的催化中心，敲除HOIP基因的小鼠胚胎因血管内皮细胞死亡，出现血管生成缺陷，成为导致胚胎死亡的主要原因，但肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1)的消融可防止这种现象发生，提示LUBAC及其线性泛素链是通过防止TNFR1介导内皮细胞死亡维持胚胎发育过程中血管的完整性[9]。LUBAC和其线性泛素链缺陷，可以使TNFR1信号将从促炎激活信号转变为诱导细胞死亡信号[8-9]。LUBAC可以通过调控核转录因子κB关键调节器(NF-κB essential modulator，NEMO)和受体相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1，RIPK1；NF-κB通路的关键调控因子)等的线性泛素化，参与NF-κB信号通路的调节[10]。OTULIN可以通过保守的PIM结构域与HOIP的PUB结构域特异性结合，进而参与对NF-κB通路的调节[3,11]。LUBAC的过度表达会增强NF-κB的活性，LUBAC组分的敲除导致NF-κB活性降低[9]。OTULIN通过限制LUBAC介导的NEMO和RIPK1等的线性泛素化，抑制NF-κB信号转导，被认为是NF-κB通路的负性调节因子[12]。若HOIP-OTULIN相互作用丧失，会导致限制LUBAC诱导的NF-κB通路激活失败，提示OTULIN对LUBAC诱导的NF-κB通路的活性调节需要HOIP与OTULIN结合才能实现[8]。单独用TNF对OTULIN耗竭的角质细胞进行刺激，出现细胞的LUBAC活性受到抑制，表现为NEMO和RIPK1的Met1-Ub降低，NF-κB通路活性降低，细胞死亡增加。同时，OTULIN失活，增加LUBAC的自动泛素化程度，从而破坏NF-κB激活所需的TNFR1相关复合物Ⅰ(TNFR1-associated complex Ⅰ)即复合体Ⅰ的稳定性，促进细胞死亡引发信号复合体(death initiating signaling complex，DISC)即复合体Ⅱa的形成，进而导致细胞死亡，因此认为OTULIN主要是通过抑制LUBAC的自动泛素化维持LUBAC的功能，而非抑制LUBAC的活性[7,13-14]。调控过程见图1。

图 1 OTULIN对NF-κB信号通路的调控示意图Fig.1 Diagram of OTULIN regulating NF-κB pathway

4 OTULIN调节TNF-α诱导的NF-κB通路参与炎症、免疫反应

4.1 TNF-α可诱导NF-κB通路的激活 NF-κB是一种转录因子，由二聚体组成，可被多种刺激激活。活化NF-κB参与调节天然免疫和适应性免疫的过程，且与胚胎着床、早期胚胎发育等过程密切相关[15]。TNF-α是一种多效性细胞因子，参与一系列生理过程，特别是炎症、细胞生存和细胞死亡。TNF-α是NF-κB的强烈诱导剂，可以使巨噬细胞和组织中的NF-κB活性增强。NF-κB的活化可引起具有κB结合位点基因的转录，这些基因大多数参与炎症、免疫应答和细胞活力的调节。NF-κB信号通路的过度活化参与人类妊娠丢失、感染性休克、肿瘤、哮喘、炎症性肠病、肾小球肾炎、类风湿关节炎等疾病的发生。TNF-α激活其受体TNFR1后，形成跨细胞膜的多聚蛋白复合物TNFR1-SC，即TNFR1相关复合物Ⅰ，该复合物由TNFR1相关死亡结构域(TNFR1 associated death domain，Tradd)、TNFR相 关 因 子2(TNFR associated factor 2，TRAF2)、细胞凋亡抑制蛋白1/2(cell inhibitor of apoptosis protein 1/2，cIAP1/2)和RIPK1组成，进而招募LUBAC。LUBAC产生的 Met1-Ub修饰RIPK1和NEMO形成NEMORIPK1复合物，使得IkB激酶复合体(IkB kinase，IKK)被激活，激 活的IKK可以磷酸 化IκBα蛋白，使其被泛素化，被蛋白酶体降解，从而释放出NF-κB，游离NF-κB二聚体(最常见的是p50/p65异二聚体)转运到细胞核，启动相应靶基因的转录[3]。

4.2 OTULIN突变影响NF-κB信号通路发挥调控作用 OTULIN通过阻断LUBAC形成的Met1-Ub抑制NF-κB信号通路的激活[12]。OTULIN不同的点突变可能对细胞中TNF信号和NF-κB通路产生不同的反应。OTULIN相关自身炎症反应综合征(OTULIN-related autoinflammatory syndrome，ORAS)，主要由脱泛素酶OTU结构域的纯合错义突变(p.L272P和p.Y244C)和移码突变(p.G174Dfs*2)所致[11]，主要表现为婴儿出生后的全身炎症反应，最后均进展为复发性结节性脂膜炎，并伴不同程度的中性粒细胞浸润、复发性发热、生长发育不良、关节疼痛肿胀、血清免疫球蛋白和自身抗体水平升高等。p.Y244C和p.G174Dfs*2突变的ORAS患者NF-κB信号通路明显激活，且激活程度与患者症状的严重程度呈正相关，OTULIN含量与体内NF-κB信号激活程度呈负相关[11]。此外，OTULIN基因突变患者细胞内Met1-Ub水平明显上升，抗TNF治疗可以逆转ORAS患者的炎症状态[11,14]。对于OTULIN Gly281Arg突变所致的ORAS患者来说，成纤维细胞中OTULIN的丢失导致LUBAC水平降低和对TNF反应减弱，与OTULIN缺乏的单核细胞中TNF信号和NF-κB激活增加相反。C129A突变的OTULIN仍可导致NF-κB活化程度降低，推测突变的OTULIN催化活性并未完全丧失，结合泛素链发挥NF-κB信号通路的负性调节效应[16]。但OTULIN缺乏的成纤维细胞和OTULIN缺乏的单核细胞都对TNF诱导的死亡敏感，ORAS患者损伤皮肤中细胞凋亡明显存在，移植造血干细胞可以完全消除机体的炎症反应，故认为ORAS的发病机制涉及高炎性免疫细胞和TNF诱导的相关细胞死亡[14]。

4.3 OTULIN和LUBAC缺乏引起细胞死亡8周龄OTULIN缺乏的小鼠，肝病理可以逐渐经过脂肪变性-脂肪性肝炎-纤维化-癌前病变，到7 ～ 12月龄时发展为肝细胞癌， 提示OTULIN可以防止小鼠肝细胞的死亡、炎症和代谢紊乱，类似于ORAS患者[17]。有研究显示，OTULIN缺陷引起小鼠肝细胞中Met1-Ub累积，使得TNF对NF-κB的信号转导受到抑制，肝细胞对Caspase依赖的外源性凋亡敏感，进而导致肝细胞死亡，因此OTULIN在保护肝细胞免于死亡、防止慢性肝炎进展为肝癌方面发挥重要作用[4]。但OTULIN缺乏的肝病理结果与TNFR1信号无关，这与ORAS患者不同[17]。OTULIN缺乏的人和小鼠炎症的主要驱动力是TNF[9,11]，但OTULIN缺乏的细胞反应存在明显的细胞特异性，如在髓系细胞中，OTULIN缺乏导致LUBAC高表达和NF-κB激活[11,14]。而在成纤维细胞，OTULIN缺失致LUBAC降解和TNF诱导的细胞死亡[7,14]。关于T细胞和B细胞中OTULIN是否参与了Met1-Ub募集化过程仍存在争议[1,5,11,18]。

5 OTULIN和LUBAC功能丧失与细胞死亡

人和小鼠LUBAC的功能丧失和亚型突变会导致一种潜在且致命的早发性炎症性疾病，并伴有免疫缺陷，最终导致细胞死亡，发展为类似于LUBAC受损患者的自体炎症综合征[11,14]。在妊娠小鼠中，OTULIN的功能异常导致内皮细胞死亡，血管生成受损，最终导致胚胎死亡，其表型与LUBAC功能缺陷相似[7]。OTULIN缺陷的成年小鼠在24 h内即死亡[11]，考虑OTULIN和LUBAC通过不同的信号通路影响细胞的炎症免疫反应和细胞死亡[14]，而且OTULIN和LUBAC具有广泛的相互作用蛋白，远远超过目前研究的认知[18]。

在TNF-α刺激的OTULIN缺乏细胞中，RIPK1线性泛素化水平升高的同时，也导致RIPK1赖氨酸(Lys)63连接的泛素化增加，而使用小分子HOIP抑制剂抑制Met1-Ub水平，会进一步促进OTULIN缺陷细胞的Lys63泛素化水平升高，促进细胞死亡，表明RIPK1线性泛素化促进细胞存活，而RIPK1的Lys63连接泛素化可促进细胞死亡[19]。ORAS患者角质细胞中OTULIN的耗竭抑制了LUBAC在TNF信号中的活性，但RIPK1和Lys63-Ub水平增加，导致细胞死亡[13]。OTULIN过表达通过对Met1-Ub的影响抑制NEMO-RIPK1复合物的形成，从而使细胞对TNF-α诱导的细胞死亡敏感[20]。OTULIN过表达也可激活JNK通路促进细胞死亡诱导过程中的两个关键调控因子PARP和Caspase-3裂解，进一步促进细胞的死亡。另外，在OTULIN基因敲除细胞中，也会出现JNK和c-Jun磷酸化，导致细胞死亡，故认为OTULIN的过度表达和敲除都会导致细胞死亡，而调节的关键在于线性泛素链在细胞中的表达水平[1]。同时OTULIN在Tyr-56处过磷酸化，损害HOIP-OTULIN结合，改变RIPK1的泛素化动态，产生由RIPK1、FADD和Caspase-8组成的TNFRⅡa而广泛地诱导细胞凋亡[13]。

此外，有研究在缺血性脑卒中大鼠模型中证实电针治疗可以通过调节OUTLIN表达控制NF-κB通路的活性，从而减轻脑卒中对神经细胞功能和胶质细胞激活状态从而发挥脑保护作用[21]，提示OUTLIN可作为一个潜在治疗靶点。此外OUTLIN也有调控自噬和mTOR信号通路的作用[22-23]，但具体机制尚不清楚。

6 结语

OTULIN作为一种新发现的特异性线性泛素链去泛素化酶，参与细胞的炎症免疫反应和细胞死亡等过程，OTULIN如何通过对Met1-Ub水平的影响参与细胞死亡过程及其对不同细胞的作用机制仍需进一步研究。另外，磷酸化的OTULIN是否及如何影响OTULIN的生理作用，如何参与细胞死亡的过程仍不清楚。鉴于OTULIN负性调控NF-κB通路的功能，在不良妊娠结局的预防和治疗中，有可能作为NF-κB通路相关炎性疾病的治疗靶点，为获得理想的妊娠结局提供一种新方法。