卵巢癌患者循环肿瘤细胞中ERCC1表达与铂类药物敏感性的关系

赵海波，徐 翔，丁佳佳，赵恩锋

解放军总医院 妇产科，北京 100853

卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤，早期无明显特异性症状，70%确诊时已属晚期。虽然肿瘤减灭术+铂类为基础的联合化疗可以使多数患者达到临床缓解，但仍有超过50%患者出现复发，少数患者甚至在化疗过程中出现复发[1]。铂类耐药是上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)复发的主要原因。研究表明只有20%复发患者在随访早期发现，绝大多数复发患者发现时已失去最佳治疗时机[2]。所以寻找一种能够早期预测铂类药物敏感性的指标是目前EOC治疗研究的主要方向。核酸切除修复(nucleotide excision repair，NER)途径是修复铂类药物导致的DNA损伤的重要机制。切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementation group 1，ERCC1)是 NER途径的限速酶[3-6]。早期研究显示肿瘤组织中ERCC1表达产物(如蛋白质或mRNA)可作为预测铂类化疗疗效的生物学指标。但目前研究表明基于肿瘤组织的ERCC1表达产物不能指导临床预测铂类药物敏感性[7-9]。这可能与肿瘤细胞的异质性有关。循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)是原发或转移肿瘤组织脱落入循环系统的肿瘤细胞，能够实时反映肿瘤细胞在体内情况[10]。本文研究CTC中ERCC1的表达与EOC患者临床特征、铂类药物敏感性的关系。

对象和方法

1 对象 以2015年3月- 2017年6月本院诊治的60例EOC患者为研究对象。纳入标准：1)病理诊断为EOC；2)已行满意的肿瘤细胞减灭术(残留病灶直径＜1 cm)，术后计划行6个疗程卡铂/紫杉醇化疗(周期为21 d)；3)化疗完成后达到完全临床缓解。排除标准：1)同时合并其他恶性肿瘤；2)化疗期间更改化疗方案；3)未完成6个疗程化疗；4)出现严重并发症化疗延迟。均经患者本人及家属签署知情同意书，研究方案经解放军总医院伦理委员会批准。

2 标本收集 所有患者手术后化疗前、3个疗程化疗后1周内分别抽取空腹外周血5 ml至含有EDTA抗凝剂中，抽血部位为肘正中静脉，为防止穿刺皮肤时皮肤细胞污染，每次都弃去前面的2 ml血。

3 样本处理 肿瘤细胞富集：将5 ml外周血样本颠倒混匀，加入15 ml红细胞裂解液混匀，室温静止30 min裂解红细胞。500×g离心5 min，去除上清液；使用终浓度为4%的甲醛固定剩余细胞沉淀8 min；将固定后的细胞转移至过滤管中(含滤膜)，使用真空抽滤泵将细胞过滤至滤膜上。过滤后的含细胞的滤膜，使用4%甲醛继续室温固定1 h。固定后的含有细胞的滤膜使用PBS洗涤3次，置于24孔板中。加入0.1 mg/ml蛋白酶K进行处理，室温静置1 h，增加细胞膜通透性。加入特异性捕获探针，包括上皮型生物标记探针EpCAM、CK8/18/19、间质型生物标记探针(vimentin、twist、zeb1)、白细胞标记物CD45、ERCC1探针进行杂交，显微镜进行自动拍照分析，根据标记红色荧光信号(上皮型标记物)或绿色荧光信号(间质型标记物)CTC分型(图1)，标记蓝信号点代表白细胞，紫色信号点代表ERCC1的表达(图2)。通过荧光信号判断白细胞、CTC以及ERCC1的表达情况。

4 随访 通过住院病历及电话随访收集患者的年

图 1 CTC分型镜检图(×100倍油镜)A：上皮型CTC(红)； B：混合型CTC(红+绿)； C：间质型CTC(绿)Fig. 1 Different types of CTC images by florescence microscopeA：Epithelial CTC (red fluorescence); B：E-M mixed CTC (red and green fluorescence); C：Msenchymal CTC (green fluorescence)

图 2 CTC中ERCC1表达(紫色)(×100倍油镜)A：上皮型CTC中ERCC1表达； B：混合型CTC中ERCC1表达； C：间质型CTC中ERCC1表达Fig. 2 ERCC1 expression of CTC (the purple fluorescence for ERCC1 expression)A：ERCC1 expression in epithelial CTC; B：ERCC1 expression in E-M mixed CTC; C：ERCC1 expression in msenchymal CTC

龄、家族史、病理类型、腹水情况、腹水细胞学情况、残余病灶、FIGO分期等方面资料。铂类敏感型复发：铂类药物化疗结束后达到完全临床缓解后复发，复发时间＞6个月；铂类耐药型复发：铂类药物化疗结束后达到完全临床缓解后复发，复发时间＜6个月。根据化疗前后ERCC1 + CTC数目变化将ERCC1 + CTC患者分为化疗后ERCC1 +CTC数目升高组(ERCC1 + CTC-H组)和ERCC1 +CTC数目未升高组(ERCC1 + CTC-L组)。随访截止时间为2018年1月1日，因随访时间短未完成全部患者无进展生存期及总生存期随访。

5 统计学方法 数据分析应用SPSS24.0软件进行处理，计数资料采用率表示，两组间比较采用Fishers精确检验；计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 ERCC1 + CTC检出率 60例中83.3%(50例)检测出CTC，60%(36例)检测出ERCC1 + CTC。36例ERCC1 + CTC阳性中，检出率最高为混合型CTC 32例(86.11%)，上皮型及间质型分别28例(77.78%)、26 例 (72.22%)。

表1 两组患者的临床特征分析Tab. 1 General clinical characteristics of two groups

2 ERCC1 + CTC患者临床特征 36例检测出ERCC +CTC患者中，浆液性癌28例(77.78%)，FIGO分期Ⅲ期、Ⅳ期26例(72.22%)。ERCC1 + CTC-L组24例 (66.67%)，ERCC1 + CTC-H 组 12例 (33.33%)。两组年龄、家族史、病理类型、腹水情况、腹水细胞学情况、残余病灶、FIGO分期等均无统计学差异(P＞0.05)。ERCC1 + CTC-L组中62.5%(15例)铂类药物敏感，ERCC1 + CTC-H组中16.7%(2例)铂类药物敏感，两组差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

讨 论

目前多项临床研究已经证明CTC是导致肿瘤转移和复发的主要原因，其在肿瘤疗效评估方面有广泛的应用[11-16]。目前研究表明ERCC1在铂类耐药中起关键作用[17-18]。因此EOC患者外周血CTC中ERCC1表达可作为预测铂类药物敏感性的一个指标。

本研究入组60例患者，CTC表达ERCC1患者36例(60%)，根据化疗前后ERCC1 + CTC数目变化分为ERCC1 + CTC-H组和ERCC1 + CTC-L组，结果显示，两组年龄、家族史、病理类型、腹水情况、腹水细胞学情况、残余病灶、FIGO分期等均无统计学差异(P＞0.05)，铂类药物敏感性差异有统计学意义(P＜0.05)，提示ERCC1表达量增加提高了肿瘤组织DNA损伤修复能力，临床上表现为对铂类药物的耐药性增强。Du等[19]体外研究发现，慢病毒介导的RNAi沉默ERCC1基因能逆转耐药性EOC细胞SKOV3/DDP对顺铂的耐药性，提示ERCC1表达量下降可增强铂类药物敏感性，与本研究的结果一致。

本研究采用纳米滤膜结合RNA原位杂交技术，CTC检出率为83.3%(50/60)，ERCC1 + CTC检出率为60%(36/60)。Kuhlmann等[1]对143例EOC患者进行研究，14% CTC被检出，8% ERCC1 + CTC被检出。Kuhlmann等利用免疫磁性分离技术富集CTC，其原理是利用特异性抗体(EpCAM/MUC/mucin1)与CTC表面特异性抗体结合，将CTC直接分离出来。造成其CTC检出率低的可能原因：1)这种分离方法主要依赖CTC表面抗原表达，不表达或低表达目标抗原的CTC将会被漏筛。恰恰其所使用抗体均为上皮细胞抗体，无法筛选间质型CTC；2)在磁场中会发生细胞聚集且与磁柱结合的CTC不易洗脱；3)在磁场中聚集的细胞活性和形态受到影响[20]。由于循环肿瘤细胞的检出率低，使得ERCC1 + CTC检出率也下降。本研究采用纳米滤膜结合RNA原位杂交技术，利用肿瘤细胞直径较一般体细胞大的特点，有效避免了由于部分抗原缺失及磁场因素导致的CTC漏筛。此技术可将CTC进一步分为上皮型、混合型、间质型，并可根据荧光强度对ERCC1表达量进行分级。CTC分型及ERCC1表达分类有助于对ERCC1 + CTC进一步深入研究。

综上所述，ERCC1 + CTC在EOC患者中有较高的检出率，其在EOC患者治疗过程中的动态变化与化疗疗效有一定的关系，有可能作为预测铂类药物敏感性的有效指标，指导EOC患者的个体化治疗，提高EOC治疗疗效。但由于本研究随访时间短，样本例数少，未能完成无进展生存期及总生存期的统计，需进一步扩大样本量并延长随访时间，进一步研究ERCC1 + CTC与EOC预后的关系。

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