前列腺癌组织SOX7、SOX9表达及其诊断和预后评估价值

刘 涛，张 璐，张 凡

江汉大学附属医院 泌尿外科，湖北武汉 430015

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性发病率最高的恶性肿瘤之一，也是导致癌症相关死亡的主要原因[1]。流行病学调查显示，近20年我国前列腺癌发病率呈逐年上升趋势，而患者5年存活率依然低于30%[2]。因此，早期诊断和预后评估对前列腺癌患者具有重要意义。前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)是前列腺癌诊断最常用的生化指标[3]。但PSA存在诊断灰区，前列腺增生、急性前列腺炎、急性尿潴留等均可使血清PSA升高。研究证实，SOX家族基因(SOX genes，SOXs)在恶性肿瘤的发生、迁移和侵袭中发挥重要作用[4]。秦国强等[5]报道在肿瘤启动子甲基化的作用下，前列腺癌组织SOX7 mRNA和蛋白表达明显下调，提示SOX7可以作为前列腺细胞是否癌变的检查点之一。SOX9是前列腺芽上皮早期分化的关键基因，前列腺癌细胞SOX9表达上调可以导致细胞周期阻滞、分化抑制和凋亡敏感性增加，提示SOX9与前列腺癌的发生、生长和侵袭密切相关[6]。本研究采用免疫组化染色方法检测前列腺癌组织和前列腺增生组织SOX7、SOX9表达水平，旨在探讨SOX7、SOX9蛋白检作为前列腺癌诊断和预后评估指标的可行性。

材料和方法

1 资料和标本收集 2011年5月- 2015月5月江汉大学附属医院经病理学证实为前列腺癌患者78例(包括前列腺根治术39例，前列腺电切术19例和前列腺穿刺标本20例)，年龄25 ～ 78岁，平均(57.4±6.7)岁。纳入标准：病理组织经病理学证实为PCa，分期不限。排除标准：既往行手术、化疗或放疗等抗癌治疗；取材前1周发生急性尿潴留或有前列腺炎症病史。78例患者再根据Gleason评分分为2个亚组：＜7分组51例和≥7分组27例。另收集同期在医院行手术治疗的60例前列腺增生症患者作为对照，年龄26 ～ 75岁，平均(60.1±5.3)岁，排除取材前1周行直肠指检、前列腺按摩或经直肠前列腺B超者。

2 免疫组化染色检测组织SOX7、SOX9表达 从液氮中取出患者样本组织，常规石蜡包埋，制成厚度约为4μm的连续切片。二甲苯脱蜡、无水乙醇梯度水化，微波加热修复抗原。每张切片滴加1滴过氧化物室温孵育15 min，PBS冲洗3次；再滴加1滴山羊血清封闭15 min；弃去血清，PBS冲洗1遍，分别滴加SOX7单克隆抗体(1∶150)、SOX9单克隆抗体(1∶200)，置于孵育盒内，4℃孵育过夜。第2天将过夜的切片用PBS冲洗3次，再滴加生物素标记的羊抗小鼠IgM二抗，室温孵育15 min。DAB显色，当出现棕黄色背景后立即用蒸馏水反复冲洗终止反应，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片，以细胞质和细胞核内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达。

3 免疫组化染色评分标准 显微镜下每张切片随机选择5个高倍视野，以细胞核或细胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒作为阳性细胞；根据染色强度和阳性细胞比例判定实验结果。染色强度：0分为不着色；1分为淡黄色；2分黄色；3分为棕黄色。阳性细胞比例：0分为阳性细胞比例＜5%；1分为阳性细胞比例5% ～ 25%；2分为阳性细胞比例26% ～ 75%；3分为阳性细胞比例76% ～ 100%。阳性判定：0 ～ 2分为阴性；3分为阳性。以PBS代替一抗作为阴性对照，由两名病理科医生独立阅片评分。

4 随访 病理确诊为前列腺癌时开始对患者进行规律的门诊复查或电话随访，以各种原因所致死亡(前列腺癌相关死亡或其他原因死亡)或不明原因失访为随访终点，进行生存相关统计时将其他原因死亡和失访者作为删失数据处理。本研究随访截止日期为2017年5月31日。

5 统计学方法 采用SPSS19.0软件包进行数据处理，计量资料以±s表示，两组比较采用t检验；计数资料比较采用χ2检验或Fishers确切概率法。采用受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线，评价SOX7、SOX对前列腺癌的诊断价值，曲线下面积的比较采用Z检验。采用Kaplan Meier法及Log Rank法检验不同SOX7、SOX9表达水平的前列腺癌患者生存率。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 两组SOX7、SOX9阳性率比较 SOX7主要分布于前列腺组织细胞质内，呈黄色或棕褐色颗粒。SOX9主要分布于前列腺组织细胞质和(或)细胞核内，呈棕褐色颗粒(图1)。根据疼痛数字评分，前列腺癌组织SOX7阳性率为37.2%(29/78)，前列腺增生组织SOX7阳性率为78.3%(47/60)，前列腺癌组织SOX7阳性率明显低于前列腺增生组织(χ2=23.213，P＜0.001)。前列腺癌组织SOX9阳性率为73.1%(57/78)，前列腺增生组织SOX9阳性率为45.0%(27/60)，前列腺癌组织SOX9阳性率明显高于前列腺增生组织(χ2=11.224，P＜0.001)。见表1。

2 前列腺癌组织SOX7、SOX9表达与临床病理参数的关系 SOX7、SOX9表达与前列腺癌患者年龄无关(P＞0.05)；Gleason＜7分组SOX7阳性率高于≥7分组，Ⅰ～Ⅱ期组SOX7阳性率明显高于Ⅲ～Ⅳ期组，无淋巴结转移组SOX7阳性率明显高于淋巴结转移组(P均＜0.05)。Gleason≥7分组SOX9阳性率明显高于＜7分组，Ⅲ～Ⅳ期组SOX9阳性率明显高于Ⅰ～Ⅱ期组，淋巴结转移组SOX9阳性率明显高于无淋巴结转移组(P均＜0.05)。见表 2。

表1 两组SOX7、SOX9阳性率比较Tab.1 Comparison of positive rate of SOX7 and SOX9 between two groups

表2 SOX7、SOX9表达与前列腺癌患者临床病理参数的关系Tab. 2 Relationship between expression of SOX7 and SOX9 and clinicopathological parameters in patients with prostate cancer (n, %)

3 SOX7、SOX9对前列腺癌诊断的价值 SOX7(1.15分)诊断Gleason＜7分前列腺癌的AUC为0.679(95% CI：0.563 ～ 0.780)，SOX9(2.87分)的 AUC为0.856(95% CI：0.759 ～ 0.925)，SOX9诊断Gleason＜7分前列腺癌的AUC高于SOX7(Z=2.041，P=0.044)。SOX9诊断的敏感性为72.7%，特异性为94.6%，见图2A。SOX7(4.12分)诊断Gleason≥7分前列 腺 癌 的 AUC 为 0.885(95% CI：0.792 ～ 0.946)，SOX9(4.78分 )的 AUC 为 0.761(95% CI：0.651 ～0.850)，SOX7诊断Gleason≥7分前列腺癌的AUC高于SOX9(Z=2.335，P=0.020)。SOX7诊断的敏感性为95.5%，特异性为67.9%，见图2B。

4 SOX7、SOX9表达与前列腺癌患者预后的关系利用Kaplan Meier检验分析患者总体生存率，结果显示SOX7阳性组总体生存率明显高于SOX7阴性组 (χ2=4.438，P=0.035，图 3A)。SOX9 阳性组总体生存率明显低于SOX9阴性组(χ2=4.059，P=0.041，图 3B)。

讨 论

作为高迁移率组超家族成员，SOXs中已被证实有20多个成员与细胞增殖、分化有关。然而不同SOXs成员发挥的作用也不一样，如SOX3可以引起胃壁细胞的癌变，是一种癌基因[7]；而SOX10则作为一种抑癌基因参与调节黑色素瘤的免疫治疗[8]。因此SOXs具有组织特异性，不同组织来源的肿瘤细胞具有不同的生物学功能。不同组织在信号刺激下，可以使激活的SOXs参与到不同的信号通路中，从而使SOXs表现出抑癌和促癌的双重作用。

Costa等[9]报道称SOX7可以抑制连环蛋白的激活，阻断由连环蛋白介导的下游基因及相关转录过程。这也提示SOX7可以作为前列腺癌潜在的“检查点”。郭艳丽等[10]证实敲除SOX7基因的小鼠肿瘤增殖、分化的速度明显加快。免疫组化研究也发现前列腺癌组织SOX7表达明显下调[11]；说明SOX7可能作为抑癌基因参与调节前列腺癌的生物学过程。SOX9是SOXs家族研究较多的基因。王震等[12]证实SOX9表达上调可以诱导细胞分化并促进细胞周期进展。Durando等[13]称在小鼠前列腺早期发育阶段，SOX9表达增加，而敲除SOX9基因会导致小鼠前列腺发育畸形，提示SOX9在前列腺芽早期分化阶段发挥关键作用。在恶性肿瘤方面，崔连艳等[14]利用免疫组化染色法检测食管鳞癌组织SOX9表达，结果显示癌组织SOX9表达明显高于癌旁组织。上述研究说明SOX9可能在肿瘤的发生中有类似癌基因的作用。

图 1 免疫组织化学染色检测前列腺癌和前列腺增生组织SOX7、 SOX9表达(×200)Fig. 1 Expression of SOX7 and SOX9 in prostate cancer and hyperplasia prostate by immunohistochemical staining(×200)

图 2 SOX7、SOX9诊断前列腺癌的ROC曲线A：SOX7(1.15分)、 SOX9(2.87分)诊断Gleason＜7分前列腺癌的ROC曲线；B：SOX7(4.12分)、 SOX9(4.78分)诊断Gleason≥7分前列腺癌的ROC曲线Fig. 2 ROC curve for diagnosis of prostate cancer with SOX7 and SOX9A： ROC curve for SOX7 score (1.15) and SOX7 score (2.87) diagnosis prostate cancer with Gleason＜7; B: ROC curve for SOX7 score(4.12) and SOX7 score (4.87) diagnosis prostate cancer with Gleason≥7

图 3 SOX7、 SOX9阳性的前列腺癌患者生存曲线A：SOX7阳性的前列腺癌患者总体生存率； B：SOX9阴性的前列腺癌患者总体生存率Fig. 3 Survival curve of prostate cancer patients with SOX7 + SOX9A： Over-all survival of positive prostate cancer patients by SOX7; B: Over-all survival of negative prostate cancer patients by SOX9

本研究发现，前列腺癌组织SOX7阳性率明显低于前列腺增生组织，而SOX9阳性率明显高于前列腺增生组织，提示前列腺癌组织中SOX7呈低表达，SOX9呈高表达，证实了SOX7的抑癌作用和SOX9的促癌作用。秦国强等[15]的研究发现前列腺癌中SOX9受Wnt/β-catenin信号通路的调节，活化的SOX9基因通过转录一系列下游基因促进肿瘤细胞的增殖。Molofsky等[16]也证实SOX9和SOX10在前列腺癌组织中高表达，并与SOX7呈负相关。本研究进一步研究了SOX7和SOX9表达与前列腺癌患者病理参数的关系，结果发现SOX7与Gleason评分、TMN分期和淋巴结转移呈负相关，而SOX9与Gleason评分、TMN分期和淋巴结转移呈正相关。因此通过检测组织SOX7、SOX9可以将前列腺癌与良性病变区分开来，并在很大程度上能够为前列腺癌早期诊断提供依据。本研究继续采用ROC曲线分析SOX7、SOX9对不同进展程度的前列腺癌的诊断价值，结果显示当SOX9的最佳临界值为2.87分时，SOX9诊断Gleason＜7分前列腺癌的AUC高于SOX7，说明SOX9对早期前列腺癌的诊断价值更高。而当SOX7的最佳临界值为4.12分时，其诊断Gleason≥7分前列腺癌的AUC高于SOX9，提示SOX7对进展期前列腺癌的诊断价值更高。我们推测可能是在前列腺癌早期病变中，癌基因SOX9发挥的作用更大；而进展期前列腺癌中，抑癌基因SOX7表达逐渐增加，并开始发挥作用。这一猜测也得到Stovall等[17]的证实，该作者发现随着乳腺癌的不断进展，SOX7表达逐渐增加，从而发挥机体自身的抗癌作用。

肿瘤患者的生存预后与癌细胞的增殖、侵袭有关。因此，理论上影响肿瘤发生和进展的因素也会对患者预后产生影响。为了证实上述推断，本研究对前列腺癌患者进行长期随访，结果显示SOX7阳性组总体生存率明显高于SOX7阴性组，SOX9阳性组总体生存率明显低于SOX9阴性组，说明SOX7阳性表达和SOX9阴性表达可能是前列腺患者良好预后的标志。现有证据表明，雄激素受体水平是前列腺癌不良预后的关键，发生雄激素抵抗的前列腺癌患者死亡率明显增加[18-19]。Jiang等[20]报道称SOX9可以抑制雄激素抵抗作用，而SOX7则可以增加雄激素的敏感性。因此我们认为SOX7和SOX9可能是通过雄激素受体信号通路调节前列腺癌细胞的发生和进展。在接下来的研究中，我们将重点研究SOX7和SOX9与雄激素受体信号通路的关系。

综上所述，前列腺癌组织中SOX7呈低表达，而SOX9呈高表达，SOX7、SOX9可以作为前列腺癌诊断和预后评估的分子标记物。

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