血清miR-132及miR-183对胃癌的诊断价值

陈卿奇，李巨元，冯彩团，郑继统，赵高传

海南西部中心医院 消化科，海南儋州 571799

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤，死亡率在我国居全部恶性肿瘤的第2位[1]。尽管已有研究报道细胞增殖、凋亡、侵袭、上皮间质转化、耐药相关基因表达异常与胃癌的发生有关，但其基因表达调控的上游机制尚未明确。微小核糖核酸(microRNA，miR)是一类小非编码RNA分子，参与调控基因的表达，对细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭和转移均起重要作用[2-4]。近年来研究表明，miR-132及miR-183在正常组织和肿瘤组织中的表达显著不同，可能在肿瘤的诊断、治疗方面扮演重要角色[5-7]。本研究通过检测血清miR-132及miR-183在胃癌患者中的表达情况，分析其对胃癌的诊断价值，旨在为该病的早期诊断提供依据。

对象和方法

1 研究对象 选取2014年1月- 2017年3月海南西部中心医院经手术病理证实的胃癌患者96例，其中男65例，女31例，年龄35 ～ 86 (62.84±10.36)岁。TMN分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期14例，Ⅲ期40例，Ⅳ期24例。纳入标准：1)术前均未接受放疗、化疗及免疫治疗；2)未并发其他肿瘤。排除严重肝肾疾病、内分泌代谢疾病及其他结缔组织病。另选择同期45例体检正常者作为对照组，其中男28例，女17例，年龄38 ～ 80(60.46±9.72)岁。两组性别、年龄等一般资料差异均无统计学意义(P均＞0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

2 主要仪器和试剂 RNA提取试剂盒购自美国ABI公司，在ABI 7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)上进行实时定量PCR法(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)。5810R高速冷冻离心机 (Eppendorf)。

3 Real-Time PCR检测 抽取两组研究对象的空腹静脉血3 ml于未加抗凝剂的离心管中，轻轻颠倒数次后静置10 min，于室温下2 500 r/min离心15 min，吸取上层血清400μl转移至1个EP管中，-70℃保存。参考血清microRNA快速提取试剂盒的使用说明书提取血清总microRNA。以U6为实验内参，microRNA逆转录反应体系：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。于ABI 7500型荧光定量PCR仪中行扩增和荧光信号检测。扩增条件：95℃10 min 1个循环，95℃15 s、60℃ 60 s进行45个循环，实验重复3次。每个反应体系中荧光信号达到所设定阈值经历的循环数即为Ct值，以U6为内参照，采用法计算miR-132及miR-183的相对表达水平，其中△

4 统计学分析 采用SPSS19.0统计软件分析，计量资料以-x±s表示，组间比较采用成组t检验。绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic，ROC)评价血清miR-132及miR-183对胃癌的诊断价值，曲线下面积(area under curve，AUC)的比较采用Z检验。相关性分析采用Pearson相关检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 两组血清miR-132及miR-183表达水平比较胃癌组血清miR-132(0.64±0.08 vs 0.12±0.03)及miR-183(5.13±0.34 vs 0.87±0.05)表达水平均明显高于对照组(P均＜0.05)。见图1。

图 1 两组血清miR-132及miR-183表达水平比较Fig.1 Comparison of expression level of serum miR-132 and miR-183 in two groups

图 2 血清miR-132及miR-183诊断胃癌的ROC曲线Fig.2 ROC curves of serum miR-132 and miR-183 in diagnosis of gastric cancer

表1 血清miR-132及miR-183对胃癌的诊断价值Tab. 1 Diagnostic value of serum miR-132 and miR-183 in gastric cancer

2 血清miR-132及miR-183对胃癌的诊断价值血清miR-132联合miR-183诊断胃癌的AUC(95%CI)为 [0.958(0.892 ～ 0.996)]，明显优于 miR-132[0.864(0.805 ～ 0.926)]和 miR-183[0.904(0.845 ～ 0.967)](P均＜0.05)。血清miR-132及miR-183诊断胃癌的最佳截值分别为0.35、2.68。两项联合诊断胃癌的敏感度和特异度较好，分别为96.2%和87.4%。见图2和表1。

3 胃癌患者血清miR-132与miR-183的相关性Pearson相关分析显示，胃癌患者血清miR-132与miR-183呈正相关(r=0.758，P＜0.01)。见图3。

图 3 血清miR-132与miR-183的相关性Fig.3 Correlation between serum miR-132 and miR-183

讨 论

胃癌的发生是一个多基因、多因素共同作用的结果，其发病机制复杂，涉及蛋白质编码的原癌基因和抑癌基因的遗传学和表观遗传学改变。microRNA是一类高度保守的内源性非编码单链RNA，其广泛存在于真核生物中，长度约为22个核苷酸，通过在转录后水平调控靶基因的表达，参与各种重要的生物学过程，如细胞增殖、分化和凋亡，病毒防御、肿瘤转移、血管形成及免疫应答等，microRNA在肿瘤的发生发展中可能发挥着重要作用[8-9]。研究表明，microRNA可以稳定存在于痰液、血清及组织中，同时发现microRNA在恶性肿瘤患者中的表达水平与健康人存在明显差异，这些特性使得microRNA有望成为新的肿瘤标记物[10]。近期研究发现，miR-132及miR-183在多种恶性肿瘤中异常表达，且不同恶性肿瘤组织miR-132及miR-183的表达水平不同，miR-132及miR-183对肿瘤早期诊断、转移、分期和预后评估等方面具有重要的提示作用[11-12]。本研究显示，胃癌组血清miR-132及miR-183表达水平均明显高于对照组，提示miR-132及miR-183在胃癌患者中异常高表达，可能通过发挥癌基因的作用来调节胃癌的发生发展过程。Liu等[13]研究表明，血清miR-132表达水平在胶质瘤组织中明显高于正常脑组织，高表达miR-132的胶质瘤患者预后较差。Sarver等[14]研究发现，miR-183作为保守进化的microRNA族成员，在肿瘤中发挥类似原癌基因作用，通过反向调节肿瘤抑制基因和(或)控制分化或凋亡基因促进肿瘤发生。由此推测miR-132及miR-183与肿瘤发生、发展密切相关，有可能是一类新的肿瘤癌基因，在人类肿瘤的发病机制中发挥关键作用。

本研究应用ROC曲线分析显示，血清miR-132联合miR-183检测对预测胃癌发生具有较高的价值，其AUC值为0.958(0.892 ～ 0.996)，敏感度和特异度为96.2%和87.4%。相关分析显示，胃癌患者血清miR-132与miR-183呈正相关。说明miR-132及miR-183可作为诊断胃癌发生的新型生物标记物，两项联合检测有助于提高胃癌诊断的准确性。Liu等[15]通过检测79例胃癌患者的癌组织和正常组织中miR-132表达水平，并分析其与预后的关系，发现miR-132在胃癌组织中明显上调，可作为预测胃癌预后的独立分子标记物。孙颖等[16]研究发现，血清miR-183表达水平上调与胃癌发生、发展有关，其诊断胃癌发生及淋巴结转移的AUC值为0.978(0.955 ～ 1.001)、0.643(0.507 ～ 0.780)，miR-183 有望成为胃癌诊断及预后判断的分子标记物。另有研究表明，miR-132及miR-183高表达对恶性肿瘤的总生存率有显著影响，它可作为恶性肿瘤诊断和预后评估的一种新型肿瘤标记物[17-18]。由此可见，血清miR-132及miR-183测定提供了一种非侵入性的胃癌检测方法和辅助诊断方法，在未来有较好的应用前景。

综上所述，血清miR-132及miR-183上调与胃癌发生、发展有关，两项联合检测有助于提高胃癌早期诊断的准确性，同时也为阐明胃癌癌变的分子机制提供新的线索。

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