中晚期癌症患者使用抗PD-1单抗治疗前后外周血淋巴细胞刺激性免疫检查点GITR和OX40的变化及与疗效的关系

杜无双，胡 毅

解放军总医院 肿瘤内科，北京 100832

近年来，免疫治疗用于抗肿瘤的研究不断深入，取得了重大突破，在免疫检查点抑制剂方面取得了令人瞩目的成果[1-2]。PD-1是T细胞表面一个重要抑制性分子，又名程序性死亡受体1，与其配体PD-L1结合对T淋巴细胞激活和免疫耐受有重要作用。PD-1PD-L1通路是目前研究比较深入的肿瘤免疫相关通路之一，阻断此通路可以解除肿瘤的免疫抑制状态，使得机体自身的免疫功能重新发挥杀伤肿瘤作用，达到治疗肿瘤的目的。目前获批的PD-1抑制剂纳武单抗(Nivolumab)和帕母单抗(Pembrolizumab)已用于多种实体瘤的治疗，其有效率为20% ～ 30%，这对于部分晚期癌症患者来说是令人振奋的[3-6]。但是对于另一部分患者来说，免疫治疗并没有带来预期的效果，那么这部分患者的肿瘤微环境与治疗有效患者的差异，以及患者在接受免疫治疗后，T细胞表面其他免疫检查点表达的差异值得探究。GITR和OX40是表达于淋巴细胞表面的两个刺激性免疫检查点，多项相关研究正在开展。GITR为糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)。主要表达于活化的T淋巴细胞，协同刺激T淋巴细胞增殖分化。有研究表明GITR的高表达增加了CD4+CD25+调节性T细胞数量[7-8]。另一个刺激性免疫检查点OX40也属于肿瘤坏死因子受体超家族，其唯一配体OX40L主要表达于抗原提呈细胞表面，其激活T淋巴细胞后可以促进细胞因子的分泌和细胞因子受体的表达。研究表明，激动型OX40抗体在耗竭肿瘤浸润性调节性T细胞方面发挥重要作。目前有多个作用于OX40通路的单克隆抗体处于临床试验阶段[8-9]。中晚期肿瘤患者接受抗PD-1单抗治疗后，免疫检查点GITR和OX40是否会因为免疫环境的改变而发生变化，这种变化有什么规律？本实验基于以上思考通过动态检测外周血T淋巴细胞GITR和OX40表达的变化探究其与免疫治疗疗效的关系。

资料和方法

1 资料来源 选取2016年12月- 2017年8月在本院肿瘤内科住院并行抗PD-1单抗免疫治疗的21例中晚期癌症患者。排除既往接受过免疫治疗的患者。所有患者均经术后病理或组织活检确诊为中晚期癌症。

2 抗PD-1单抗治疗 每14 d或21 d为一个周期，每周期接受1次Nivolumab单抗(3 mg/kg)或Pembrolizumab单抗(2 mg/kg)治疗。单独使用PD-1单抗或联合化疗使用。所有患者接受治疗前后均无明显异常或不可耐受的不良反应。

3 免疫治疗检测 分别于每次接受免疫治疗前1 d采集患者外周血5 ml，置于含肝素的抗凝管中送检。通过流式的方法检测外周血CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和NK细胞上GITR和OX40免疫检查点的表达情况。使用Beckman流式细胞仪进行检测，分别用CD3-PC7(Beckman)、CD8-FITC(Beckman)、CD56-PC5(Beckman)标记 T淋巴细胞，用两种免疫检查点对应的抗体染色，检测后用Flowjo流式软件进行数据绘图记录GITR和OX40的表达情况，并进行汇总。

4 疗效判定及分组 每2个周期进行影像学检查，根据RECIST1.1判定疗效。疗效分为完全缓解(complete remission，CR)、部分缓解(partial remission，PR)、病变稳定 (stable disease，SD)、病变进展(pregressive disease，PD)。CR、PR、SD为有效，PD为无效。

5 统计学方法 采用统计学软件SPSS22.0和GraphPad Prism 7.0对实验数据进行统计分析。采用t检验比较两组免疫检查点表达水平，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 纳入患者一般情况 21例中，男性16例，女性5例；年龄39 ～ 81岁，平均年龄58岁。其中肺癌15例，食管癌2例，宫颈癌2例，尿道肿瘤2例。其中两周期评价疾病进展(PD)的5例为无效组；其他16例为有效组，其中3例两周期评价疾病缓解(PR)，13例两周期评价疾病稳定(SD)。见表1。

2 免疫治疗前后无效组与有效组GITR和OX40的变化情况 第1次免疫治疗前后，有效组和无效组GITR和OX40的表达情况无明显差异。第2次免疫治疗后，无效组CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和NK细胞上GITR的表达明显高于有效组(P＜0.05)，GITR表达在有效组表达接近零。无效组OX40在CD4+T淋巴细胞上表达高于有效组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1。

讨 论

PD-1在维持T细胞耗竭中发挥重要作用，肿瘤细胞可以利用PD-1通路逃避免疫应答[10-12]。针对此通路的PD-1单抗在晚期肿瘤治疗中取得的成果令人振奋，更带动了肿瘤免疫治疗研究的热潮。自2014年Nivolumab首次被FDA批准用于二线治疗非小细胞肺癌以来，PD-1单抗已获批应用于8种晚期恶性肿瘤的治疗，如黑色素瘤、NSCLC、经典霍奇金淋巴瘤、HNSCC、肾细胞癌、尿路上皮癌、肝细胞癌以及微卫星不稳定性高(MSI-H)或错配修复基因(MMR)缺陷的结直肠癌[13-14]。在Keynote和Checkmate系列研究中显示PD-L1能够在一定

表1 21例晚期癌症患者临床资料Tab. 1 Clinical characteristics of 21 patients

图 1 第二次免疫治疗后GITR (A)和OX40 (B)在有效组和无效组表达的差异Fig. 1 Expression of GITR (A) and OX40 (B) after second cycle of immunotherapy

Squam: Squamous; NSCLC: non-small cell lung cancer; SCLC: small cell lung cancer; PR: partial response; SD: stable disease; PD: progressive disease;5-FU: 5-flourouracil; Bev: bevacicumab; Car: carboplatin; Cis: cisplatin; Epi: epiepirubicin; Ifo: ifosfamide; Ipi: ipilimumab; Iri: irinotecan; Pem: pemetrexed;Rad: radiation; T: albumin taxol程度上预测免疫治疗的疗效，PD-L1表达高的患者接受PD-1治疗后客观有效率(ORR)较高，但是其检测技术尚有不确定性。不同的抗体、平台、评估体系，相同的临床标本得到的PD-L1表达水平结果不尽相同，并且有些患者虽然PD-L1阴性但仍然对PD-1单抗的治疗有效，临床工作中每次免疫治疗前后获取可检测的肿瘤组织进行监测可行性不高[15-19]。液体检测是免疫治疗疗效辅助判断方法中较为有效的一个手断。通过抽取患者静脉血，以流式的方法对多个免疫检查点的表达进行动态检测，能从一方面反映肿瘤患者的免疫状态。实验结果显示OX40和GITR均在无效组表达较高，可能的原因：1)这两个共刺激性免疫分子都表达在活化的T细胞上并且能逆转调节性T细胞(Treg)的抑制作用，其流式检测表达在无效组高于有效组，可能是由于其未结合配体在体内发挥刺激免疫的作用，而是暴露在外结合了检测用的抗体；2)患者接受PD-1单抗治疗后，免疫系统受到刺激产生负反馈，有效组患者因为PD-1通路的抑制作用解除导致共刺激性分子表达下降，属于机体的自我保护，避免产生细胞因子风暴[7,9,20-22]。

综上，通过液体检测的手段，动态监测免疫检查点的变化情况可以反映患者免疫状态，还可以作为预测PD-1单抗疗效的指标。但仍需大样本量的研究探索GITR和OX40表达变化的原理及与免疫治疗的关系。

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