体外冲击波干预治疗对大鼠肌腱损伤修复的观察

马 玲，贾子善，肖红雨，张立宁，戈含笑

解放军总医院 康复医学中心，北京 100853

体外冲击波干预治疗对大鼠肌腱损伤修复的观察

马 玲，贾子善，肖红雨，张立宁，戈含笑

解放军总医院 康复医学中心，北京 100853

目的 探讨体外冲击波干预对大鼠肌腱损伤后组织形态和相关生长因子表达的影响。方法 选择健康雄性Wistar大鼠43只，随机分为治疗组20只、对照组20只、空白组3只。空白组大鼠不做任何处理，治疗组和对照组的40只大鼠制作肌腱慢性跟腱损伤模型。治疗组给予损伤跟腱处冲击波干预治疗，冲击能量为0.16 mJ/mm，冲击次数3 000；每天治疗1次，连续治疗1周。对照组不做任何处理。分别在治疗后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d处死大鼠，取跟腱组织，光镜下观察组织学形态，并采用双抗夹心ELISA方法进行肌腱组织血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)含量测定。结果 对照组在损伤后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d可以观察到受损跟腱纤维排列较紊乱，修复过程中再生肌腱纤维不明显，瘢痕组织形成；治疗组经过体外冲击波治疗后1 d、3 d、7 d可以看到受损跟腱组织内胶原纤维排列不规则，跟腱周围组织充血、水肿；在14 d、21 d时，跟腱内腱细胞的数量开始增多，再生的胶原纤维排列比较整齐，未见明显瘢痕组织。对照组跟腱组织在伤后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d时VEGF含量逐渐增加，21 d时VEFG含量达到最大；治疗组中经冲击波干预后1 d、3 d、7 d、14 d，VEGF的表达逐渐增高，至14 d时达到最高点，21 d时表达反而减少。结论 体外冲击干预治疗可以改善大鼠损伤肌腱的修复。

体外冲击波；生长因子；肌腱损伤

肌腱损伤是运动医学和康复学中的常见病、多发病[1]。在损伤修复过程中，如何促进受损组织的愈合和功能的恢复是个值得研究的课题。既往研究表明，很多生长因子对软组织损伤(包括肌腱)后的修复均有促进作用[2]。但是目前对肌腱中生长因子的研究较少。体外冲击波(extracorporeal shock wave therapy，ESWT)疗法是利用冲击波的物理性质对人体的肌肉、骨骼、内脏等组织的病变进行治疗的疗法[3]。本研究通过制作大鼠肌腱慢性损伤模型，应用体外冲击波干预治疗，对肌腱组织的形态进行观察并检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)含量，以探讨冲击波治疗肌腱损伤的机制。

材料和方法

1实验动物 由解放军总医院动物实验室提供雄性健康Wistar大鼠43只(取双后足共86个样本)，大鼠均为4周龄，平均体质量(200±6.8) g。适应性喂养3 d后，随机选取3只大鼠作为空白组，另外40只随机分为治疗组和对照组，每组20只。

2实验仪器和试剂 自制电刺激造模装置(参考末端病大鼠损伤模型机制建立方法[4])：装置底部为长约90 cm的平板，平板上放置一排铁棒，平行排列。装置四周用铁皮封闭。将底部的铁棒用导丝串联在一起，铁棒与周围的铁皮之间形成绝缘现象，确保不出现导电问题。实验用VEGF试剂盒购自上海生物制药有限公司。

3大鼠肌腱慢性损伤造模 通过“电击跳跃法”建立大鼠肌腱损伤—肌腱慢性损伤动物模型。造模装置底部连接电源，使相邻两个铁棒之间形成电流，将大鼠的脚同时踩在相邻两个铁棒上固定好，接通外接电，电压设定在50 V。通过铁棒电击大鼠足部，大鼠为了躲避足底电流的强烈刺激，被迫采取向上跳跃姿势。本研究设定大鼠双足同时跳离铁棒为有效跳跃，如只有一足离开，则不算有效刺激。每次通电时间间隔15 s，连续刺激大鼠20 min，休息15 min，再持续刺激20 min。每天进行电刺激1次，每周共刺激6次，持续刺激6周。造模期间，给予大鼠充足的水和纯鼠料喂养，保证大鼠营养。造模后检查大鼠跟腱组织结构，符合慢性跟腱末端病标准为造摸成功。治疗组和对照组的所有大鼠进行肌腱损伤造模处理，3只空白组大鼠不做任何处理。

4冲击波治疗 使用项宇医疗型号为XY-KSHOCK MASTER-500的体外冲击波治疗仪，在造模成功后第1天，治疗组大鼠行常规麻醉，跟键末端区体外冲击波干预。冲击能量为0.16 mJ/mm，冲击次数3 000；每天治疗1次，连续治疗1周。对照组采用同样麻醉手段，以排除麻醉等外在因素干扰，但不给予冲击波干预治疗。

5跟腱标本采集及处理 冲击波干预治疗后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d，治疗组和对照组分别随机取4只大鼠双腿跟腱处组织。空白组3只麻醉处死，取出6个跟腱组织。取材后，用预冷的0.9%氯化钠注射液清洗，放入4%的多聚甲醛固定液中，4℃固定24 h。放入10% EDTA液脱钙。入梯度乙醇脱水(75%→85%→95%→100%)，二甲苯透明处理，石蜡包埋。连续切片，脱蜡，乙醇脱水，常规HE染色。

6肌腱组织VEGF含量测定 用“酶联免疫吸附法”(ELISA)检测43只大鼠跟腱组织中VEGF含量。

7数据处理 采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，数据采用-x±s表示，组间均数差异比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1造模成功 大鼠跟腱慢性损伤造模。跟腱组织形态学HE染色显示，腱组织玻璃样变、肉芽组织增生、血管侵入，胶原纤维致密排列消失，互相融合，折光性增强，染色变差，腱细胞大多消失。符合跟腱慢性损伤模型标准。

图 1 大鼠跟腱组织(HE染色×400) A：空白组； B：对照组14 d； C：治疗组14 d； D：对照组21 d； E：治疗组21 dFig. 1 HE staining of tendon tissue in rats A: blank group; B: control group at 14 d; C: treatment group at 14 d; D: control group at 21d; E: treatment group at 21 d

2治疗组和对照组在治疗前后跟腱组织HE染色比较 对照组在1 d、3 d、7 d、14 d、21 d时受损跟腱纤维排列紊乱，周围组织充血、水肿，内可见大量的炎性细胞浸润，肌腱细胞增大，核淡染，再生的肌腱纤维不明显，可见瘢痕组织形成。治疗组1 d、3 d、7 d时可以观察到受损的跟腱组织内胶原纤维排列不规则，跟部分腱周围组织充血、水肿，腱细胞核清晰，染色浅，呈现嗜碱性，在14 d、21 d时，跟腱组织出现腱细胞的再生愈合，但愈合情况并不完善，腱细胞数量增多，再生的胶原纤维排列比较整齐，基本未见胶原瘢痕组织的出现。见图1。

3跟腱组织中VEGF含量表达比较 对照组损伤跟腱组织在伤后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d VEGF表达逐步增高，在21 d时VEGF含量达到最高；治疗组干预后1 d、3 d、7 d、14 d VEGF含量逐步增高，至14 d时达到最高点，21 d时表达较14 d时减少，说明治疗组的损伤跟腱组织修复较快，在21 d时修复已基本完成。见表1。

表1 两组大鼠不同时间点跟腱组织处VEGF表达量比较Tab.1 Expression level of VEGF in the tendon tissue of rats in treatment group and control group)

表1 两组大鼠不同时间点跟腱组织处VEGF表达量比较Tab.1 Expression level of VEGF in the tendon tissue of rats in treatment group and control group)

P＜0.05, vs control group

Group (n=20) VEGF (ng/L) 1 d3 d7 d14 d21 d Control21.2±17.2 52.8±21.4 116.2±31.1 245.5±52.4 382.3±48.4 Treatment 49.1±18.3 88.5±23.3 198.3±30.5 309.5±58.3 248.2±34.2 P0.0020.0030.0150.0070.000

讨 论

肌腱损伤临床上多指发生在肌腱处的疼痛、肿胀和功能障碍等[5]。关于跟腱损伤的发病机制目前认为[6-7]，当跟腱组织自身损伤的同时造成周围组织的血管等结构受到损伤，使此区域内的血液循环出现障碍，造成跟腱组织结构发生变性、水肿、炎性渗出、无菌性炎症等变化。

本研究从组织HE染色观察发现，治疗组在治疗后1 d、3 d、7 d可以观察到受损的腱组织内胶原纤维排列不规则，部分跟腱周围组织充血、水肿，在14 d、21 d时，跟腱组织出现腱细胞的再生愈合，腱细胞数量增多，胶原纤维排列较整齐，未见胶原瘢痕组织，其组织恢复过程比对照组明显要好。说明冲击波可以促进肌腱组织内毛细血管的生成、胶原蛋白的合成、成纤维细胞的生成等，其机制可能是冲击波在大鼠跟腱组织中传导时，导致作用部位内微循环加速，加速毛细血管的血液循环，增强组织细胞的吸氧能力，从而促进损伤组织修复[8-9]。同时当冲击波作用于损伤组织时，由于各组织的密度不同，能量在组织中传递过程中，可以在不同界面产生不同的机械应力，这种应力可以改变细胞形态，引起组织松解，加速局部微循环。

既往研究发现，VEGF是由肌腱、肌肉等多种组织产生的一种高效的促细胞分裂的细胞因子，在机体组织修复过程中可产生趋化、合成、分泌、增殖等作用；还可增强脂肪、蛋白质和糖原的合成，促进细胞分裂增殖等[2,10-12]。VEGF是血管再生和生长时重要的生长因子，可以加速局部组织内血管的再生，促进受损组织的修复[13-16]。研究证明，VEGF能够促进肌腱细胞的增殖和基质的合成，通过改善肌腱代谢水平来增强受损肌腱组织的愈合[17-19]。本实验研究发现，冲击波干预可以促进损伤肌腱早期VEGF的表达，使其峰值更高，VEGF水平表达的增高可以进一步促进组织的修复程度，21 d时VEGF表达减少，HE染色切片显示跟腱组织结构比较完整，说明组织损伤后的修复正在进行，冲击波可加速损伤组织的修复过程。

综上所述，冲击波的刺激作用能够促进受损组织内的生长因子释放，增加组织内微循环，促进腱细胞的增殖以及细胞外基质的合成，在一定程度上减少或者避免受损组织的粘连，有利于受损组织的修复。因此，体外冲击波疗法可作为治疗慢性肌腱损伤的首选疗法之一。

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Effect of shockwave treatment on tendon injury in rats

MA Ling, JIA Zishan, XIAO Hongyu, ZHANG Lining, GE Hanxiao
Department of Rehabilitation Medicine, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

JIA Zishan. Email: zwy2pxs@126.com

Objective To evaluate the effect of extracorporeal shock wave therapy on rats with tendon injury. Methods Forty-three male rats were randomly selected and divided into 3 groups: treatment group (n=20), control group (n=20), blank group (n=3). Rats n blank group did not receive any treatment, and tendon injury models were established with rats in treatment and control groups. Rats from treatment group were given extracorporeal shock wave therapy with the power of 0.16 mJ/mm for 3 000 times, once per day for a week, and then rats were sacrifced after treatment for 1 d, 3 d, 7 d, 14 d, 21 d. The tendon tissue were taken and observed under light microscope. Morphology changes and VEGF levels were detected and evaluated by ELISA. Results In control group, he tissue of tendon showed irregular arrangement, the regenerated tendon fber was unapparent, and scar tissue was formed after njury for 1 d, 3 d, 7 d, 14 d, 21 d. While in treatment group, the tissue of tendon was observed with edema and hyperemia and the collagen fber network was destructed after treatment for 1 d, 3 d, 7 d. The tendon cells were regenerating, the collagen fber network howed regular arrangement, and no apparent scar tissue was observed at 14th d, 21th d after treatment compared with control group. The level of VEGF in control group increased gradually after injury for 1 d, 3 d, 7 d, 14 d, and it achieved its maximum at 21th d. In herapy group, the level of VEGF increased at 1st d, 3rd d, 7th d, 14th d after treatment, and it achieved its maximum at 14th d, while t decreased at 21th d. Conclusion Extracorporeal shock wave therapy can improve the repair of injury tendon effectively.

extracorporeal shock wave therapy; growth factor; tendon injury

R 493

A

2095-5227(2015)09-0932-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.09.020

时间：2015-05-27 10:08

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150527.1008.001.html

2014-12-25

全军医学科技青年培育项目(13QNP170)

Supported by the Medical Science and Technique Training Foundation or Youths of the Chinese People's Liberation Army(13QNP170)

马玲，女，硕士，主管技师。研究方向：康复医学与理疗学。Email: 35209161@qq.com

贾子善，男，主任医师。Email: zwy2pxs@126.com