高脂饮食诱导的C57BL/6J幼鼠肾足细胞中Synaptopodin的表达及意义

沈 健，臧东钰，李晓明

辽宁医学院 组织胚胎学教研室，辽宁锦州 121001；2辽宁医学院附属第三医院 胸外科，辽宁锦州121001

高脂饮食诱导的C57BL/6J幼鼠肾足细胞中Synaptopodin的表达及意义

沈 健1，臧东钰2，李晓明1

辽宁医学院 组织胚胎学教研室，辽宁锦州 121001；2辽宁医学院附属第三医院 胸外科，辽宁锦州121001

目的 探讨足细胞骨架蛋白Synaptopodin在高脂饮食所致肾发育期足细胞损伤中的表达及意义。方法 32只3周龄雄性C57BL/6J幼鼠随机分为正常饮食组和高脂饮食组，分别给予标准饲料与高脂饲料喂养4周。检测葡萄糖耐量水平、尿微量白蛋白与尿肌酐；观察小鼠肾的病理形态学改变，应用免疫组织化学和免疫印迹技术检测小鼠肾足细胞中Synaptopodin的表达变化。结果 与正常饮食组相比，高脂饮食组小鼠体质量显著增加，葡萄糖调节受损，尿微量白蛋白与尿肌酐比率增高。镜下可见肾小球肥大，肾小囊腔内渗出，系膜基质轻度增生等病理改变。同时足细胞Synaptopodin的表达明显降低。结论 Synaptopodin在高脂饮食诱导的C57BL/6J幼鼠肾足细胞中表达显著降低，并出现蛋白尿。

高脂饮食；足细胞；突触足蛋白；免疫组化；免疫印迹

儿童期肥胖会增加肾疾病的发病率，并且在出现高血压或糖尿病之前就已出现肾功能障碍[1-2]。高脂饮食会引起肥胖并导致体内脂质和葡萄糖代谢紊乱[3]。而脂质和葡萄糖代谢紊乱是许多原发和继发性肾疾病发生、发展的的关键环节[4-5]。因此，阐明高脂饮食对发育期肾损伤的影响及机制具有重要意义。本研究采用免疫组织化学技术及免疫印迹技术观察高脂饮食对C57BL/6J幼鼠肾功能、肾组织形态学以及肾足细胞骨架蛋白Synaptopodin表达的影响，探讨Synaptopodin在高脂饮食所致肾发育期足细胞损伤中的作用及意义，为进一步阐明高脂饮食所致肾损害的发病机制提供实验依据。

材料和方法

1动物饲养 3周龄雄性C57BL/6J小鼠32只，将小鼠随机分为正常饮食组(n=16)和高脂饮食组(n=16)。正常饮食组给予标准饲料，高脂饮食组给予高脂饲料，饲料均购自美国Research Diets公司，喂养4周。各组小鼠分别于饲养0周、1周、2周、3周和4周时称量体质量。饲养4周后进行葡萄糖耐量实验，并收集尿液用于测定尿白蛋白与尿肌酐。

2葡萄糖耐量实验 实验前将小鼠禁食16 h，称重，腹腔注射葡萄糖溶液(2 mg/g)，分别在注射葡萄糖后即刻、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min尾部取血，用血糖仪检测血糖水平。

3ELISA试剂盒检测尿微量白蛋白与尿肌酐 收集尿液，离心后收集上清。空白孔加样品稀释液50μl，余孔分别加标准品及待测样品50μl，室温孵育120 min。加酶标试剂50μl，室温孵育60 min。加50μl 1×SP conjugate，室温孵育30 min。加显色剂至出现明显的梯度蓝色，待标准孔由蓝色转变成黄色，加终止液终止反应。用酶标仪在450 nm波长下依序测量各孔的光密度(OD值)。

4免疫组织化学染色 各组小鼠饲养4周后，麻醉(2%戊巴比妥腹腔注射)，4%多聚甲醛行心脏灌流，取肾。右肾入-80℃冰箱中保存。左肾入4%多聚甲醛固定液固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片5μm。石蜡切片脱蜡至水，3% H2O2室温孵育10 min，枸橼酸盐高压修复，正常山羊血清封闭。滴加兔多克隆抗体Synaptopodin(1∶200)，4℃过夜，滴加HRP抗兔IgG 37℃孵育。DAB显色，复染，脱水，透明，封片。以PBS代替一抗作阴性对照。光学显微镜下观察并摄片。Synaptopodin蛋白表达在细胞质，以出现黄色或棕黄色的细小颗粒着色为阳性。

5Western blotting测定 取肾组织剪碎，加入裂解液，离心，取上清。灌胶，加样，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭，兔多克隆抗体Synaptopodin(1∶500)，4℃过夜。二抗室温孵育，ECL显色。应用FluorchemⅤ2.0系统进行光密度测。Synaptopodin蛋白的分子量为74 kU，以目的条带与内参照GAPDH平均吸光度的比值表示蛋白水平，进行半定量分析。

6统计学处理 应用SPSS17.0软件进行统计分析，实验数据用-x±s表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1高脂饮食对小鼠体质量的影响 将3周龄的幼鼠分组喂养4周后，可见高脂饮食组小鼠体型偏胖，体毛光泽，其体质量较正常饮食组明显增加(P＜0.05)。见表1。

2葡萄糖耐量实验 高脂饮食组小鼠葡萄糖负荷在各时间点的血糖水平明显高于正常饮食组(P＜0.05)，而且血糖下降水平较为缓慢，表明高脂饮食小鼠喂养4周后葡萄糖调节受损。见图1。

3小鼠尿微量白蛋白/尿肌酐比率 高脂饮食组小鼠的尿微量白蛋白/尿肌酐比率(albumin/creatinine ratio，ACR)明显高于正常饮食组。见图2。

4小鼠肾病理形态学 与正常饮食组相比，高脂饮食组小鼠肾组织出现了肾小球肥大，肾小囊腔内可见渗出，系膜基质轻度增生等病理改变。见图3。

5免疫组化染色 正常饮食组小鼠肾足细胞中Synaptopodin表达较强(图4)。高脂饮食组小鼠肾足细胞中，Synaptopodin的表达明显减弱。见图5。

6免疫印迹结果 与正常饮食组相比，高脂饮食组Synaptopodin蛋白的表达水平明显下降。见图6。

图 1 高脂饮食组和正常饮食组小鼠葡萄糖耐量实验Fig. 1 Glucose tolerance test of high-fat diet group and normal diet group

图 2 高脂饮食组和正常饮食组小鼠尿微量白蛋白/尿肌酐比率Fig. 2 Ratio of albumin/creatinine of high-fat diet group and normal diet group

表1 正常饮食组和高脂饮食组小鼠体质量比较Tab. 1 Body weight of normal diet and high-fat diet group ()

表1 正常饮食组和高脂饮食组小鼠体质量比较Tab. 1 Body weight of normal diet and high-fat diet group ()

aP＜0.05, vs normal diet group

Group (n=16)0 week1st week2nd week3rd week4th week Normal diet10.78±1.3415.86±0.8118.94±1.1221.31±0.8523.60±1.21 High-fat diet10.86±0.8418.39±1.2623.09±1.05a26.49±1.18a28.58±1.07a

图 3 高脂饮食组小鼠肾HE染色(×1 000)Fig. 3 HE staining in kidney of highfat diet mice (×1 000)

图 4 正常饮食组小鼠肾Synaptopodin免疫组化染色 (×1 000)Fig. 4 Expression of Synaptopodin in kidneys of normal diet mice by immunohistochemistry (×1 000)

图 5 高脂饮食组小鼠肾Synaptopodin免疫组化染色 (×1 000)Fig. 5 Expression of Synaptopodin in kidneys of high-fat diet mice by immunohistochemistry (×1 000)

图 6 正常饮食组和高脂饮食组小鼠Synaptopodin蛋白的免疫印迹分析结果A:免疫印迹电泳图； B: Synaptopodin表达水平Fig. 6 Western blotting analysis of Synaptopodin in kidneys of normal diet and high-fat diet mice A: Electrophoretogram of western blotting; B: Expression level of Synaptopodin

讨 论

足细胞又称肾小球脏层上皮细胞，是一种高度特异性的终末分化细胞，其足突相互交错覆盖于肾小球基底膜最外侧，是肾小球滤过膜的最后一道屏障[6]。足细胞损伤与其骨架蛋白的异常表达密切相关。足细胞骨架蛋白表达异常会导致足细胞稳定性降低、细胞间信号传导障碍及滤过屏障破坏，从而引起蛋白尿及肾功能损害[7-8]。足细胞骨架蛋白主要包括肌动蛋白(actin)、α-actinin-4和Synaptopodin等[9]。Synaptopodin是一种富含脯氨酸的线状蛋白，只表达在肾小球内分化成熟的足细胞和后脑的突触内[10]。研究显示，Synaptopodin在肾足细胞的结构和动力学等方面发挥着重要作用[11]。但是目前关于Synaptopodin在高脂饮食诱导的肾发育期足细胞损伤中的作用及意义尚不清楚。

小鼠肾小体于胚龄14 d发生，生后6周达到成年水平。因此本实验以高脂饮食喂养3周龄雄性C57BL/6J幼鼠4周，观察高脂饮食对幼鼠体质量、葡萄糖耐受水平、发育期肾组织形态学以及肾功能的影响。结果显示，高脂饮食喂养4周后，小鼠体质量增长幅度较正常饮食组小鼠明显提高，同时出现了葡萄糖耐量受损，说明高脂饮食小鼠出现了肥胖和代谢紊乱的症状。Sanad和Gharib[12]对150位肥胖患儿进行研究，发现14.7%的患儿出现了微量白蛋白尿，提示肥胖是微量白蛋白尿的重要危险因素。我们的实验结果显示，高脂饮食小鼠出现了尿微量白蛋白排泄率增高。微量白蛋白尿的出现是肾功能受损最敏感的标志，因此提示小鼠肾功能已经处于早期损伤的阶段。此外，HE染色结果显示，高脂饮食组小鼠出现肾小球肥大、肾小囊腔内渗出以及系膜基质轻度增生等表现。高脂饮食组小鼠肾小球病理结构的改变与蛋白尿的发生发展密切相关。我们的研究提示，高脂饮食诱导发育期C57BL/6J小鼠出现了代谢紊乱、肾小球病理改变以及肾功能轻度受损。

足细胞骨架蛋白Synaptopodin是成熟足细胞的特异性标记物。Synaptopodin与足突的肌动蛋白微丝紧密相连，并与肌动蛋白一同导致足突结构和功能的改变[13-14]。体外培养实验发现，Synaptopodin基因缺失的足细胞会形成异常的非极性层状伪足，导致细胞迁移受损[15]。Yanagida-Asanuma等[16]认为，Synaptopodin通过将足细胞从运动型转化为收缩型来维持肾小球滤过功能的稳定。在本实验中，我们通过免疫组化及免疫印迹技术检测了Synaptopodin在高脂饮食诱导的肾足细胞中的表达变化。结果显示，与正常饮食组相比高脂饮食组小鼠肾足细胞Synaptopodin表达显著降低。足细胞损伤与蛋白尿的发生发展密切相关。足细胞的损伤和丢失会严重破坏肾小球滤过屏障的完整性，促使肾功能发生损害[17-18]。

综上所述，高脂饮食诱导的C57BL/6J幼鼠肾足细胞Synaptopodin的表达发生了变化，即表达显著降低。足细胞骨架蛋白Synaptopodin异常表达可能对足细胞结构及功能的稳定性产生影响，可能导致足细胞损伤，继而引起肾功能损害。但其具体的调控机制仍有待深入研究和探讨。

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Expression of Synaptopodin in podocytes of high-fat diet C57BL/6J young mice

SHEN Jian1, ZANG Dongyu2, LI Xiaoming1
Department of Histology and Embryology, Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China;2Department of Thoracic Surgery, the Third Affliated Hospital of Liaoning Medical College, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China

LI Xiaoming. Email: lixiaoming68327@163.com

Objective To investigate the expression and signifcance of Synaptopodin resulting in podocyte injury in high-fat diet C57BL/6J mice. Methods Thirty-two male C57BL/6J mice were randomly divided into two groups. The standard group was fed with basic diet and high-fat diet group was fed with high-fat diet for 4 weeks. Body weight and urine protein changes were measured. nsulin resistance was detected by glucose tolerance test. The kidney tissue morphological changes were examined by HE staining. The expression of Synaptopodin was examined by immunohistochemistry and western blotting. Results In high-fat diet group, the body weight was higher than the standard group, and there was signifcant decrease in glucose tolerance levels and rise in urinary lbumin/ creatinine ratio. HE staining results showed that there were glomeruli hypertrophy, mesangial matrix hyperplasia, and glomerulosclerosis. Compared with standard group, the expression of Synaptopodin in high-fat diet group reduced signifcantly in odocyte. Conclusion The expression of Synaptopodin in podocyte of high-fat diet C57BL/6J mice reduces signifcantly, which may ead to proteinuria.

high-fat diet; podocyte; synaptopodin; immunohistochemistry; western blotting

R 587

A

2095-5227(2015)09-0940-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.09.022

时间：2015-06-15 15:39

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150615.1539.001.html

2015-04-08

辽宁省高等学校优秀人才支持项目(LJQ2013092)；辽宁医学院校长基金项目(XZJJ20130243)

Supported by the Program for Liaoning Excellent Talent in University(LJQ 2013092)

沈健，男，硕士，主治医师。研究方向：肾发育与疾病。Email: 12090337@qq.com

李晓明，女，博士，教授。Email: lixiaoming68327@163. com