骨成形蛋白9在结直肠癌发生发展中的表达及临床意义

樊银杰，王 魏，孙宏治

辽宁医学院，辽宁锦州 121001

综述

骨成形蛋白9在结直肠癌发生发展中的表达及临床意义

樊银杰，王 魏，孙宏治

辽宁医学院，辽宁锦州 121001

目的 探讨骨成形蛋白9（bone morphogenetic protein-9，BMP-9）在结直肠癌演变过程中的表达及其与临床病理特征的关系。方法 收集辽宁医学院附属第一医院病理科2012年5月- 2014年10月收治的65例伴有腺瘤的结直肠癌患者的腺瘤组织、癌组织及对应的正常肠黏膜组织各65块作为研究对象，运用免疫组化方法分析BMP-9和细胞增殖因子Ki-67在这些组织中的表达情况。结果 在正常结直肠黏膜、腺瘤及癌组织中，BMP-9的阳性率分别为68%（44/65）、91%（59/65）和95%（62/65），BMP-9在结直肠癌组织中的表达水平高于腺瘤组织（P＜0.05），腺瘤组织中的表达水平高于正常肠黏膜组织（P＜0.05）；结直肠癌组织中BMP-9的表达水平与肿瘤位置、肿瘤大体类型、肿瘤组织的分化程度、组织学类型、WHO组织学分级、脉管内癌栓情况、TNM分期和血清肿瘤标记物CEA、CA19-9水平均无相关性（P＞0.05）；结直肠组织中BMP-9表达水平与Ki-67表达水平无显著相关性（P＞0.05），与腺瘤的临床病理学指标均无显著相关性（P＞0.05）。结论 BMP-9在正常结直肠黏膜、腺瘤和癌组织中的表达呈递增趋势，说明BMP-9对于结直肠肿瘤的发生、发展可能起一定的促进作用。

骨成形蛋白9；Ki-67；结直肠肿瘤；腺瘤

网络出版时间：2015-04-14 09:52 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150414.0952.001.html

结直肠癌是世界第3大恶性肿瘤，也是国内肿瘤死亡的第5大主要原因［1-2］。从腺瘤到腺癌的连续发展过程体现了大多数结直肠肿瘤患者正常肠上皮发生恶性转变的生物学行为［3-4］。因此，清楚结直肠癌发生、发展和转移的生物学行为显得尤为重要。这就需要一种新的结直肠组织表达的分子标记物来预测结直肠肿瘤发生、发展的风险，其将会在肿瘤患者个体化诊疗及改善结肠癌患者预后等方面有很大的指导意义［5-6］。骨成形蛋白9（bone morphogenetic protein-9，BMP-9）是TGF-β超家族的成员之一，也叫做生长分化因子2（growth differentiation factor-2，GDF-2）［7］。BMP-9通过调控各种不同的细胞生长过程如增殖、分化、侵袭、存活及凋亡在体内发挥着各种生理作用［8-10］，包括骨形成、肝网状内皮系统功能、造血功能、神经分化功能、体内血糖稳态、体内铁离子平衡和新生血管形成［11-17］。大量实验研究证实，BMP-9也参与了肿瘤发生、发展过程［18-26］。与BMP-9相关的肿瘤研究已有很多，但对于BMP-9在结直肠癌发生、发展、侵袭和转移方面的研究目前还没有。因此，在本实验中，我们通过对临床结直肠正常黏膜、结直肠腺瘤和结直肠癌病理切片进行BMP-9和Ki-67免疫组化染色，比较BMP-9在正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤和结直肠癌组织中表达情况，并分析BMP-9在结直肠癌组织中的表达情况与临床病理学指标的相关性，探讨BMP-9在结直肠癌发生、发展过程中的作用及临床病理意义。

材料和方法

1 标本采集 收集本院病理科2012年5月- 2014年10月被诊断为伴有腺瘤的结直肠癌患者病理组织标本65例，取其腺瘤组织、癌组织及对应的正常黏膜组织蜡块共195块，常规做成4μm的病理切片。本院血清肿瘤标记物CEA和CA19-9水平检测标准：CEA 0 ～ 3.4 ng/ml为正常，CA19-9 0 ～27 U/ml为正常。标本相关信息见表1。

2 主要病理学指标 肿瘤组织分期依据美国AJCC癌症分期手册（第7版）中的TNM分期标准［27］。肿瘤组织分级按照WHO分级标准将高分化（管状）腺癌、乳头状腺癌及中分化（管状）腺癌归为低级别，将低分化（管状）腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌、未分化癌及髓样癌归为高级别。

3 主要实验试剂 BMP-9抗体（Abcam，ab35088）和Ki-67抗体（Abcam，ab15580）均购自美国Abcam公司，免疫组化二步增强液（PV-9000）和DAB染色试剂盒均购自北京中山金桥生物公司，胎牛血清（BSA，A1933）和苏木素（MHS16）购自美国Sigma公司，中性树胶购自英国AGTC（HS-103-100ML）生物公司。

4 免疫组化检测 石蜡病理组织切片首先进行烤片并置于二甲苯中进行脱蜡处理，然后过梯度乙醇水化。在用纯水洗过后，进行抗原修复，BMP-9为pH 6.0柠檬酸钠抗原修复液高压修复，Ki-67为pH 6.0柠檬酸钠抗原修复液煮沸修复。完成后，使其缓慢恢复室温。然后用1%胎牛血清封闭1 h。分别用浓度为1∶100的BMP-9抗体和1∶250的Ki67抗体4℃过夜。然后，用二步染色增强试剂盒及DAB染色试剂盒进行染色，用苏木素复染后，进行中性树胶封片处理。每次染色均设有用封闭液（1% BSA）代替一抗的阴性对照。

5 免疫组化染色半定量评判标准 1）BMP-9根据染色强度分为4个等级：0级（无着色）评0分，1级（淡黄色）评1分，2级（黄色）评2分，3级（棕黄色）评3分。根据阳性细胞比例分为5个等级：0级（＜5%）评0分，1级（5% ～ 25%）评1分，2级（25% ～ 50%）评2分，3级（50% ～ 75%）评3分，4级（＞75%）评4分。最终评分根据两者乘积，总分为0 ～ 12分，分为4级：0分为阴性（-），1 ～3分为弱阳性（+），4 ～ 7分为中等阳性（++），8 ～ 12分为强阳性（+++）。2）Ki-67免疫组化染色结果根据阳性细胞比例评估：阳性细胞数所占比例＜10%为阴性（-），10% ～ 25%为弱阳性（+），25% ～ 50%为中度阳性（++），＞50%为强阳性（+++）。

6 统计学分析 采用SPSS20.0统计学软件。χ2检验进行组间率的比较，相关分析采用Spearman等级相关方法。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1　临床标本的主要信息Tab. 1　Main information of clinical specimen

结　果

1 BMP-9在正常结直肠黏膜、腺瘤及癌组织中的表达 BMP-9阳性染色主要定位于细胞质和细胞膜上，细胞核着色很弱或者几乎不着色。在正常结直肠黏膜、腺瘤及癌组织中，BMP-9的阳性率分别为68%（44/65）、91%（59/65）和95%（62/65）。Spearman等级相关分析，在正常肠黏膜、腺瘤和腺癌组织中BMP-9的表达水平有统计学差异（P＜0.05）。进一步两两比较，BMP-9在结直肠癌组织中的表达水平高于腺瘤组织（r = 0.221，P＜0.05），腺瘤组织中的表达水平高于正常肠黏膜组织（r = 0.572，P＜0.05），提示BMP-9在结直肠癌组织中的表达较高，腺瘤组织次之，在正常肠黏膜中表达最低。见图1、表2。

2 Ki-67在正常结直肠黏膜、腺瘤及癌组织中的表达 Ki-67阳性染色定位于细胞核，细胞质和细胞膜不着色。在正常结直肠黏膜、腺瘤及癌组织中，Ki-67的阳性率分别为82%（53/65）、100%（65/65）和98%（64/65）。Spearman等级相关分析，在正常肠黏膜、腺瘤和腺癌组织中Ki-67的表达水平有统计学差异（r = 0.711，P＜0.05）。进一步两两比较，Ki-67在结直肠癌组织中的表达水平高于腺瘤组织（r = 0.506，P＜0.05），腺瘤组织中的表达水平高于正常肠黏膜组织（r = 0.546，P＜0.05），提示BMP-9在结直肠癌组织中的表达较高，腺瘤组织次之，在正常肠黏膜中表达最低。见图1、表2。

3 结直肠腺瘤组织中BMP-9的表达水平与病理学指标的相关性 结直肠腺瘤组织中BMP-9的阳性表达与腺瘤的位置、腺瘤的单、多发性、腺瘤的组织学类型及腺瘤的不典型增生均无相关性（P＞0.05） （表3）。其中，在腺瘤上皮的不典型增生分度中，BMP-9表达阳性率在轻度不典型增生中为86%（25/29），在中度不典型增生中为96%（26/27），在重度不典型增生中为89%（8/9）。

4 癌组织中BMP-9的表达与临床病理学指标的相关性 结直肠癌组织中BMP-9的阳性表达与癌肿位置、肿瘤大体类型、肿瘤组织的分化程度、组织学类型、WHO组织学分级、脉管内癌栓情况、TNM分期和血清肿瘤标记物CEA、CA19-9水平均无相关性（P＞0.05）。见表3。

图 1　BMP-9和Ki-67在正常结直肠黏膜、腺瘤及癌组织中的表达情况（400×）A： BMP-9在正常肠黏膜组织中的表达； B： BMP-9在腺瘤组织中的表达； C： BMP-9在结直肠癌组织中的表达； D： Ki-67在正常肠黏膜组织中的表达； E： Ki-67在腺瘤组织的表达； F： Ki-67在结直肠癌组织中的表达Fig. 1　Expressions of BMP-9 and Ki-67 in colorectal carcinoma， adenoma and normal mucosa （original magnification： 400×）A： expression of BMP-9 in normal colorectal mucosa； B： expression of BMP-9 in colorectal adenoma； C： expression of BMP-9 in colorectal carcinoma； D： expression of Ki-67 in normal colorectal mucosa； E： expression of Ki-67 in colorectal adenoma； F： expression of Ki-67 in colorectal carcinoma

表2　BMP-9和Ki-67在正常结直肠黏膜、腺瘤及癌组织中的表达Tab. 2　Expressions of BMP-9 and Ki-67 in specimens of colorectal carcinoma， adenoma and normal mucosa

表3　BMP-9的表达水平与临床病理学指标的关系Tab. 3　Relationship between expressions of BMP-9 and clinicopathological characteristics of colorectal adenoma

5 癌组织中BMP-9的表达与Ki-67表达的相关性 Spearman等级相关分析结果显示，结直肠组织中BMP-9表达与Ki-67表达无显著相关性（r = -0.024，P＞0.05）。

讨　论

早在20世纪50年代，Jackman和Mayo将Dukes最先提出的结直肠肿瘤的发生大部分是由良性的腺瘤发展而来的理论正式定义为“正常肠黏膜—肠腺瘤—腺癌”顺序［28］。在形态学上，也可以发现结直肠上皮增生、腺瘤再到癌变各个阶段的发生以及相应染色体的改变。这也体现了结直肠癌的发生、发展是一个多步骤、多阶段及多基因参与的生物学事件。这一多步骤的复杂过程就使得临床上结直肠癌的诊治变得异常困难，如早期结直肠癌微小病灶漏诊率较高，治疗过程中的药物耐受等。因此，对结直肠肿瘤新的分子学标记物的发现对于临床结直肠癌的诊治意义重大。BMP-9参与人体内众多的生理病理过程，其在肿瘤发生、发展方面的研究已有很多，研究总结发现，BMP-9在肿瘤组织中的表达和对肿瘤发生、发展、转移的作用都具有种属特异性，即在不同的肿瘤中表达和所发挥的作用不同。目前，BMP-9在甲状腺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝细胞癌、骨肉瘤、骨髓瘤等多种肿瘤组织中已有相关研究，而对于结直肠癌的相关研究尚未见报道。因此，本实验将首次研究BMP-9在结直肠癌发生、发展过程中的表达情况，免疫组化染色结果提示，BMP-9主要表达于细胞质，在细胞膜和细胞核中的表达较弱或者几乎不表达；统计学结果表明，BMP-9在正常肠黏膜上皮、腺瘤和腺癌组织中的表达呈递增趋势。同时，我们也对腺瘤组织中BMP-9的表达和腺瘤的病理学特征进行了研究，发现在中、重度不典型增生的腺瘤上皮中BMP-9的阳性表达率高于轻度不典型增生。此外，我们在结直肠组织BMP-9的表达水平与临床病理学指标的相关性研究中发现，BMP-9表达水平与临床病理学指标均无明显相关性。同时，我们也对细胞增殖因子Ki-67和BMP-9表达情况进行了相关性分析，并未发现在结直肠正常肠黏膜上皮、腺瘤和腺癌组织中BMP-9的表达水平与增殖指标存在相关性，提示BMP-9在结直肠癌发生、发展过程中所发挥的作用可能与细胞增殖作用不大。

本研究首次对BMP-9在结直肠发生、发展过程中不同组织中的表达情况进行了研究，旨在探索在结直肠癌发生、发展过程中BMP-9所起的作用。也分析了结直肠腺瘤和腺癌中BMP-9的表达与临床病理学指标的相关性，这对结直肠癌的临床诊疗有极其重要的作用。本实验所选病例为伴发腺瘤的结直肠癌患者，所取的正常肠黏膜组织亦属于相应的同一患者，这一自身对照大大减少了个体组织差异性所带来的影响；同时，用于BMP-9和Ki-67的免疫组化染色切片也是出自于同一个组织蜡块，这也为分析BMP-9和Ki-67的相关性时提供了较好的对比性，在实验设计上具有一定的创新性。但是由于存在纳入研究条件的限制和病源受限的问题，致使纳入研究的病例数不足，尚不能得出较为可靠的结论；在染色条件方面，Miyamoto等［29］、Pecina-Slaus等［30］、杨其昌［31］、樊祥山［32］实验中所用的组织芯片实验效率高、实验对比度好，能够极大地降低染色实验条件前后不一致所带来的影响，而本实验中涉及的免疫组化切片数量多，在分批染色时虽然固定了统一的染色步骤和染色时间，但也会存在一定的前后染色条件差异，如所用试剂批次不一、染色环境温度的差异等，都会对实验结果产生一定的影响；此外，在进行免疫组化染色结果评判方面，虽然采用了国内外公认的半定量免疫组化评判标准（见上述免疫组化染色评判标准），但切片质量和抗原修复的影响（比如切片组织的折叠、脱落等）、组织表达蛋白强弱的个体差异性和主观因素会对染色结果的评判产生一定影响，而Guo等［33］用Image-Pro Plus图像分析软件对免疫组化结果进行较为客观的定量评估，这在一定程度上避免了本实验中染色结果评判过程中的多种干扰因素。

本实验通过对正常肠黏膜上皮组织、结直肠腺瘤组织和结直肠癌组织进行BMP-9和增殖指标蛋白Ki-67的免疫组化染色，发现BMP-9在正常肠黏膜上皮、腺瘤及腺癌这3种不同组织中的表达水平呈现逐步递增趋势。这在一定程度上说明了在“正常肠黏膜—肠腺瘤—腺癌”的经典结直肠癌演变序列中，BMP-9可能起着促进结直肠肿瘤发生、发展的作用。这一研究结果不仅发现了BMP-9在结直肠肿瘤这一新领域所发挥的作用，使我们对BMP-9的生理病理作用有更为深刻的了解；更重要的是，也确定了BMP-9这一新的结直肠癌分子生物学标记物，更加完善了结直肠癌发生、发展的作用机制。这一结论的确立，对于临床上检测结直肠癌早期进展情况和预测肿瘤预后有极其重要的指导意义。对于结直肠肿瘤的高危人群，我们可以对其定期进行正常肠黏膜活检，病理检测肠黏膜中BMP-9的表达水平，来预测结直肠肿瘤发生的风险；对于临床上结直肠腺瘤切除或者活检的患者，病理检测腺瘤组织中BMP-9的表达情况，进而推测腺瘤恶变的可能性。BMP-9的表达水平可以作为正常肠上皮和腺瘤恶变程度的一个判定指标，在临床上可以结合其他病理学特征，对结直肠癌的高危人群的预后做出一个综合的判定。若BMP-9表达水平较高，我们可以考虑预防性给予抗肿瘤干预治疗，来削弱或阻断“正常肠黏膜—肠腺瘤—腺癌”这一发展过程，提前预防结直肠肿瘤的发生。上述措施在结直肠癌早期发现和降低结直肠癌的发生率方面都有着非常重要的临床指导意义。

我们的实验通过免疫组化实验证实了BMP-9在“正常肠黏膜—肠腺瘤—腺癌”这一结直肠癌发生、发展过程中的递增趋势，但BMP-9与Ki-67的表达水平对腺瘤、腺癌的大部分临床病理学指标的影响差异均无统计学意义，考虑可能是纳入研究的病例数不足、染色条件前后一致性不好和免疫组化染色结果评判偏差等多方面的原因。因此，在以后的实验研究中，我们可以考虑适当扩大样本量，使用组织芯片和运用Image-Pro Plus或其他图像分析软件对免疫组化结果进行定量评估等实验设计，使BMP-9在结直肠癌发生、发展过程中呈递增趋势这一结论更具说服力，同时进一步研究确定BMP-9表达水平与腺瘤、腺癌的临床病理学指标的相关性。另外，在实验中，我们也发现了BMP-9在正常肠上皮黏膜组织的细胞核中有一定的表达，在细胞质中表达极弱的现象；同时也发现了在腺瘤和腺癌组织中，BMP-9在细胞核中不表达，而在细胞质和（或）细胞膜中存在着一定表达的现象。这一现象也就是在“正常肠黏膜—肠腺瘤—腺癌”组织演变过程中，BMP-9出现了核/质减少情况。但由于免疫组化实验的蛋白表达定位局限性，这一BMP-9的核-质转变的结论也存在着较大的争议。因此，在以后的研究中，可以考虑结合组织免疫荧光共染技术，更明确地定位BMP-9的表达；同时可考虑分别提取正常肠黏膜、腺瘤和结直肠癌的组织和（或）细胞中的核蛋白，细胞质蛋白和膜蛋白，通过Western blot实验对BMP-9的表达进行定量分析，进一步巩固BMP-9在结直肠癌发生、发展过程中呈递增趋势这一结论，同时探索BMP-9在“正常肠黏膜—肠腺瘤—腺癌”演变过程中的核-质转化情况，为进一步研究BMP-9在结直肠癌发生、发展过程中的作用机制提供线索。本研究仅对BMP-9在正常肠黏膜上皮组织、腺瘤组织和结直肠癌组织中的表达情况做了相关研究，得出了BMP-9有促进结直肠肿瘤发生、发展的作用，但并未进行相关机制的研究。Herrera等［19］研究发现，在卵巢癌中BMP-9可以通过其受体活化素类似物激酶（activin like kinase，ALK）Ⅱ型受体-Smad1-Smad4途径促进卵巢癌细胞增殖，Li等［20］和Herrera等［21］实验证实，BMP-9能诱发肝细胞癌的EMT，进而影响肝细胞癌的侵袭、转移过程，Yoshimatsu等研究发现，BMP-9能通过ALK1抑制肿瘤进展过程中淋巴管形成，进而抑制肿瘤的侵袭、转移过程。因此，在以后的关于结直肠癌BMP-9研究中，可以逐步探索BMP-9影响结直肠癌发生、发展、侵袭、转移的相关机制。这一机制一旦明确，对临床上更好地制订结直肠癌患者个体化诊疗方案、评估肿瘤进展情况及结直肠癌患者临床预后等方面都会产生较为重大的意义。

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Expression of BMP-9 in development and progression of colorectal carcinoma and its clinical significance

FAN Yinjie， WANG Wei， SUN Hongzhi
Liaoning Medical University， Jinzhou 121001， Liaoning Province， China
Corresponding author: SUN Hongzhi. Email: cmushz@163.com

Objective To investigate the expression of BMP-9 （bone morphogenetic protein-9） in colorectal cancer （CRC） and the relationship between BMP-9 and clinicopathological characteristics of CRC. Methods The colorectal adenoma and carcinoma tissues and its corresponding normal colorectal mucosa from 65 patients with a pathologically proven diagnosis of colorectal adenoma and adenocarcinoma from the department of pathology in the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University from May 2012 to October 2014 were examined for BMP-9 and cell proliferative factor Ki-67 expressions using immunohistochemistry. Results The positive rate of BMP-9 expression in the normal colorectal mucosa， adenoma and colorectal carcinoma was 68% （44/65）， 91%（59/65） and 95% （62/65）， respectively. The expression of BMP-9 in colorectal carcinoma tissues was significantly higher than that in adenoma tissues （P＜0.05）， and the expression of BMP-9 in adenoma tissues was higher than that in normal mucosa （P＜0.05）. However， there was no correlation between expression of BMP-9 and tumor location and types， degree of differentiation， histological type， WHO histological classification， vessel cancer embolus， TNM stage and the level of tumor marker CEA and CA19-9 in the serum of CRC （P＞0.05）. The expression of BMP-9 was not correlated to the level of cell proliferative factor Ki-67 （P＞0.05）. There was no correlation between expression of BMP-9 and clinicopathological characteristics in colorectal adenoma （P＞0.05）. Conclusion The increasing level of BMP-9 in normal colorectal mucosa- adenoma- carcinoma tissues indicates that BMP-9 may promote the development and progression of colorectal carcinoma.

bone morphogenetic protein-9； Ki-67； colorectal neoplasms； adenoma

R 735.3

A

2095-5227（2015）07-0728-06

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.07.024

2015-02-04

基金课题：吴阶平医学基金会临床科研专项资助基金（320.6750.1393）；辽宁省科学技术计划项目（2013225305）

Supported by the special funds of Wu Jie-ping medical foundation of clinical research （320.6750.1393）； Science and Technology Plan Projects of Liaoning Province （2013225305）

樊银杰，男，在读硕士。研究方向：消化道恶性肿瘤。Email: 979920276@qq.com

孙宏治，男，博士生导师，教授。Email: cmushz@163. com