脑苷肌肽对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内β-淀粉样蛋白42和钙结合蛋白-D28K表达的影响

胡亚卓，高 雅，韩志涛，夏 征，耿 艳，李瑞生，陈红艳，王建华，张红红，王鲁宁

1解放军总医院 老年医学研究所衰老与相关疾病北京市重点实验室，北京 100853；2解放军第302医院实验动物中心，北京 100039

脑苷肌肽对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠脑内β-淀粉样蛋白42和钙结合蛋白-D28K表达的影响

胡亚卓1，高 雅1，韩志涛1，夏 征1，耿 艳1，李瑞生2，陈红艳1，王建华1，张红红1，王鲁宁1

1解放军总医院 老年医学研究所衰老与相关疾病北京市重点实验室，北京 100853；2解放军第302医院实验动物中心，北京 100039

目的 观察脑苷肌肽（cattle encephalon glycoside and ignotin injection，CEGI）对APPswe/PS1dE9双转基因痴呆模型小鼠脑内β-淀粉样蛋白42（amyloid β-peptide，Aβ42）和钙结合蛋白-D28K（calbindin-D28K，CB）表达的影响，探讨CEGI对阿茨海默病（Alzheimer's disease，AD）的防治作用。方法 APPswe/PS1dE9双转基因AD模型小鼠共48只，随机分为脑苷肌肽低剂量组［Tg + CEGI-L组，腹腔注射CEGI 6.6 ml/（kg·d）］、高剂量组［Tg + CEGI-H组，腹腔注射CEGI 13.2 ml/（kg·d）］、阳性药盐酸多奈哌齐组［Tg + Donepezil组，Donepezil灌胃2 mg/（kg·d）］，模型组（Tg组，腹腔注射等体积0.9%氯化钠注射液），每组12只；同月龄同背景非转基因野生型C57BL/6J小鼠12只作为正常对照组（nTg组，腹腔注射等体积0.9%氯化钠注射液）。小鼠自5月龄开始腹腔注射给药1个月，然后进行Morris水迷宫实验检测小鼠的学习记忆能力，硫黄素S荧光染色和免疫组织化学染色检测皮质区Aβ42表达，免疫组织化学染色检测海马CA1区及CA3区CB表达的变化。结果 行为学实验，与Tg组比较，Tg + CEGI-L组小鼠空间学习和记忆能力有明显改善（P＜0.05）；小鼠大脑皮质Aβ42的表达数目在Tg组显著高于Tg + CEGI-L组和Tg + CEGI-H组（43.00±10.03 vs 24.63±10.61/24.89±6.81，P＜0.05）；小鼠海马CA1区神经元保护性蛋白CB在Tg + CEGI-L组显著高于Tg组（0.056±0.023 vs 0.031±0.001，P＜0.05）。结论 CEGI能抑制Aβ42在大脑中的聚集沉积、CB过表达来降低神经元损伤，进而改善APPswe/PS1dE9双转基因痴呆模型小鼠的学习记忆能力。

脑苷肌肽；阿尔茨海默病；APPswe/PS1dE9双转基因小鼠；β-淀粉样蛋白42；钙结合蛋白-D28K

网络出版时间：2015-04-20 10:24 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150420.1024.001.html

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是神经退行性疾病，主要病理改变为β-淀粉样蛋白（amyloid β-peptide，Aβ）沉积和老年斑（senile plaque，SP）形成、神经原纤维缠结（neurofibrillary tangle，NFT）、脑淀粉样血管病（cerebral amyloid angiopathy，CAA）及颗粒状空泡小体（granular vacuolar bodies）等［1-2］，其发病机制复杂，目前公认的主要机制是Aβ沉积、胆碱能系统受损、自由基代谢紊乱等［3］。其中Aβ产生在AD中起着非常重要的作用，主要认为Aβ在患者脑内过量产生和聚集引发了病理级联反应，最终导致神经元功能紊乱并死亡，从而引起病理性痴呆［4-5］。钙结合蛋白-D28K（Calbindin D28K，CB）是主要存在于脑内的钙结合蛋白之一，主要存在于细胞质、轴突及某些脑区神经元的树突中。有研究显示，神经元生物标记物CB可结合神经元内的钙，维持钙稳态而使神经元细胞免受钙浓度过高的毒性作用，减少SP形成，从而起到保护神经元的作用，神经元CB表达的降低与AD及神经退行性变具有相关性［6-9］。APPswe/PS1dE9双转基因小鼠模型，能模拟AD脑内Aβ的沉积和老年斑形成，对AD的早期研究有重要应用价值，是国际公认的AD动物模型［10］。脑苷肌肽（cattle encephalon glycoside and ignotin injection，CEGI）为小分子多肽氨基酸和多种神经节苷脂成分，对促进神经再生和恢复神经功能有重要作用，已在临床上广泛应用于脑卒中、老年痴呆和脑损伤等心脑血管疾病的治疗，且疗效确定［11］。我们假设CEGI的神经保护作用可能与CB有关。本研究以APPswe/PS1dE9双转基因AD小鼠为模型，观察CEGI对小鼠脑内Aβ形成和与神经元变性密切相关的CB表达的影响。

材料和方法

1 实验动物 APPswe/PS1dE9双转基因小鼠48只，同月龄同背景非转基因野生型C57BL/6J小鼠12只，均为雄性5月龄，体质量平均32.5g，相关基因APP、PS1，均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号SCXK（京）2009-0004。在解放军第302医院实验动物中心SPF级动物房单笼饲养，自由饮食。

2 实验药物与试剂 CEGI由吉林四环制药有限公司提供［批号：20121223，2 ml/支］，盐酸多奈哌齐片［卫材（中国）药业有限公司，批号：120649A，5 mg/片］作为阳性对照药。小鼠抗Aβ1-42抗体（DaKo公司）；小鼠抗CB抗体（Sigma公司）；硫黄素S（Thioflavin-S，Sigma公司）；免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

3 主要仪器 全自动脱水机（ASP 200）、组织包埋机（EG1140H）、石蜡切片机（RM 2135）及冷冻切片机（CM1900）均为德国Leica公司产品；BX60荧光显微镜、显微成像系统及图像分析系统IPP 5.1均为日本OLYMPUS公司产品。

4 实验动物分组与给药 APPswe/PS1dE9双转基因小鼠随机分为4组：转基因模型对照组（Tg组）、脑苷肌肽低剂量组（Tg + CEGI-L组）［6.6 ml/（kg·d），腹腔注射］、脑苷肌肽高剂量组（Tg + CEGI-H组）［13.2 ml/（kg·d），腹腔注射］及阳性药物多奈哌齐组（Tg + Donepezil组）［盐酸多奈哌齐2 ml/（kg·d），灌胃］。C57BL/6J小鼠12只作为正常对照组（nTg组）和Tg组均给予腹腔注射等体积0.9%氯化钠注射液，1次/d。连续给药1个月后，进行相关指标测试。

5 Morris水迷宫测试 给药4周后，对各组进行Morris水迷宫实验，检测小鼠学习记忆能力：1）定位航行实验：每只小鼠每天训练4次，连续进行5 d。每次实验小鼠游泳寻找隐藏平台的时间最多为60 s。如果超出60 s小鼠仍然没有找到平台，则将小鼠引导到平台上。动物找寻并爬上平台的时间被定为潜伏期。2）空间探索实验：最后一次学习实验结束后24 h，移除平台进行探索实验，用以检测记忆能力。探索实验中，采用新的起始位置，每次实验时间为60 s。在探索试验中，以动物在目标象限停留时间评估学习任务的优劣。

6 脑组织样品制备 小鼠于Morris水迷宫全部测试后，禁食12 h，不禁水，进行脑组织取材。用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，从左心室快速输注0.9%氯化钠注射液，并迅速剪开充盈的右心耳，此时会有大量血液涌出，灌注时间为3 ～ 5 min，直至流出清亮液体为止。于低温下快速断头取全脑，脑组织称重，右侧脑组织放入4%多聚甲醛溶液固定24 h以上（4℃），常规石蜡包埋切片；分离左侧海马和皮质，置液氮中速冻后保存于-70℃冰箱，待作生化和基因表达检测。

7 免疫组织化学测定大脑皮质Aβ42及海马CB免疫组织化学（immunohistochmeistry，IHC）分析Aβ在大脑皮质及CB在海马CA1区、CA3区的表达。经二甲苯和不同浓度乙醇脱蜡至水，0.01 mol/ L枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中微波抗原修复，3%过氧化氢溶液灭活内源性酶，滴加5% BAS封闭，一抗1∶100（Aβ42）及1∶1 000（CB） 4℃过夜，滴加生物素羊抗鼠IgG、ABC复合物，DAB显色。阴性对照切片不加一抗。硫黄素-S（Thioflavin-S）能与纤维性Aβ表面的Aβ折叠结合，从而可以检测出老年斑的沉积：1% Thioflavin-S室温孵育10 min，50%乙醇脱色后封片。光镜下，每组选取8只小鼠脑的各3张切片，每张切片选取3个不重叠视野，进行Aβ阳性细胞计数；对CB在海马CA1和CA3区的表达采用Image-Pro Plus 5.1图像分析系统进行分析，所得数据以平均光密度代表阳性颗粒的强度。

8 统计学处理 采用统计软件SPSS13.0进行统计分析，所得数据以±s表示，数据经正态分布和方差齐性检验，采用单因素方差分析，统计显著性分析使用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结　果

1 行为学实验 各组小鼠Morris水迷宫结果显示，与nTg组比较，Tg组平均逃避潜伏期显著延长（P＜0.05），目标象限停留时间显著缩短（P＜0.01）；与Tg组比较，Tg + CEGI-L组平均逃避潜伏期显著缩短（P＜0.05），目标象限停留时间显著延长（P＜0.05）；Tg + CEGI-H组目标象限停留时间显著延长（P＜0.01）；Tg + Donepezil组目标象限停留时间延长，但无统计学差异。见图1。

2 海马CA1 HE染色 nTg组海马CA1细胞排列整齐紧密、分布均匀，结构清晰，Tg组海马结构细胞层次变少，数量减少，排列紊乱，稀疏，细胞周围间隙增大。见图2。

3 硫黄素S荧光检测大脑皮质老年斑 nTg组小鼠大脑皮质区域未见绿色荧光老年斑块；Tg组大脑皮质出现较多绿色荧光老年斑块；而Tg + CEGI-L组、Tg + CEGI-H组和Tg + Donepezil组老年斑块明显减少，与Aβ42免疫组织化学的结果一致。见图3。

4 免疫组织化学检测大脑皮质Aβ42表达 Aβ42在各组小鼠大脑皮质表达及计数分析免疫组织化学结果显示，Tg 组大脑皮质出现较多Aβ42沉积；与Tg组比较，CEGI-L组、Tg + CEGI-H组和Tg + Donepezil组Aβ42明显减少（P＜0.05），免疫组织化学形态学和定量分析结果。见图4、图5。

5 CB在各组小鼠海马CA1和CA3的表达及定量分析 免疫组化结果显示，与Tg组比较，CB在nTg组和Tg+CEGI-L组小鼠的海马CA1区表达较强（P＜0.05）；免疫组织化学形态学和定量分析结果。见图6、图7。

6 CB在各组小鼠海马CA3的表达 免疫组化结果显示，与Tg组、Tg + CEGI-H组、Donepezil组比较，CB在nTg组小鼠的海马CA3区表达较强（P＜0.05）；与Tg组、Tg + CEGI-H组、Donepezil组比较，CB在Tg + CEGI-L组含量高（P＜0.05）。免疫组织化学形态学和定量分析结果。见图8、图9。

讨　论

图 1　脑苷肌肽对APP/PS1小鼠学习和记忆能力的改善作用（与Tg组比较，aP＜0.05，bP＜0.01）A： 逃避潜伏期； B： 目标象限停留时间Fig. 1　Effects of CEGI on spatial learning and memory in APP/PS1 mice （compared with Tg group，aP＜0.05，bP＜0.01）A： Escape latency； B： Taget quadrant time

图 2　各组小鼠海马CA1 （HE ×400）A：正常对照组； B：转基因模型对照组； C：脑苷肌肽低剂量组；D：脑苷肌肽高剂量组； E：阳性药物多奈哌齐组Fig. 2　HE stains for hippocampus CA1 region in each group （HE ×400）A： nTg； B： Tg； C： Tg + CEGI-L；D： Tg + CEGI-H；E： Tg + Donepezil

图 3　各组小鼠大脑皮质老年斑硫黄素-S荧光染色（×100） A：正常对照组； B：转基因模型对照组； C：脑苷肌肽低剂量组； D：脑苷肌肽高剂量组； E：阳性药物多奈哌齐组Fig. 3　Thioflavin S stains of Aβ plaque in the cortex area in each group （×100）A： nTg； B： Tg； C： Tg + CEGI-L； D：Tg + CEGI-H； E： Tg + Donepezil

图 4　各组小鼠大脑皮质Aβ42老年斑免疫组化染色 （×100） A：正常对照组； B：转基因模型对照组； C：脑苷肌肽低剂量组；D：脑苷肌肽高剂量组； E：阳性药物多奈哌齐组图 5　各组小鼠大脑皮质Aβ42定量分析（与Tg组比较，aP＜0.05）Fig. 4　IHC stains of Aβ plaque expression in the cortex area in each group （×100） A： nTg； B： Tg； C： Tg + CEGI-L ； D： Tg + CEGI-H； E： Tg + DonepezilFig. 5　Quantitative analysis of IHC stains for Aβ42 expression in the cortex area in each group （compared with Tg group，aP＜0.05）

图 6　各组小鼠海马CA1区CB免疫组化染色 （IHC×200） A：正常对照组； B：转基因模型对照组； C：脑苷肌肽低剂量组；D：脑苷肌肽高剂量组； E：阳性药物多奈哌齐组图 7　各组小鼠海马CA1区CB光密度 （与Tg组比较，aP＜0.05）Fig. 6　 IHC stains for CB expression in the hippocampus CA1 region in each group （IHC×200） A： nTg； B： Tg； C： Tg + CEGI-L； D： Tg + CEGI-H； E： Tg+DonepezilFig. 7　Optical density for CB expression in CA1 hippocampal region in each group （compared with Tg group，aP＜0.01）

图 8　各组小鼠海马CA3区CB免疫组化染色（IHC×200） A：正常对照组； B：转基因模型对照组； C：脑苷肌肽低剂量组；D：脑苷肌肽高剂量组； D：阳性药物多奈哌齐组图 9　各组小鼠海马CA3区CB光密度 （与Tg组比较，aP＜0.05）Fig. 8　IHC stains for CB expression in CA3 hippocampal region in each group （IHC×200） A： nTg； B： Tg； C： Tg + CEGI-L；D： Tg + CEGI-H； E： Tg + DonepezilFig. 9　IHC stains for CB expression in CA3 hippocampal region in each group （compared with Tg group，aP＜0.05）

正常情况下，脑组织Aβ的生成以Aβ40为主，而在AD患者脑内Aβ42的生成明显增多。虽然脑内Aβ42的含量很少，但是其片段最长、毒性最强，比Aβ40更容易聚集沉积，是形成老年斑的主要成分［12-13］。Aβ在脑内异常聚集并纤维化形成SPs，其神经毒性作用可诱发氧化应激、激活小胶质细胞、破坏钙离子稳态、激活凋亡相关蛋白并导致广泛的神经元丢失［14-15］。近来研究认为，钙稳态异常是AD中Aβ形成的关键因素，并为AD导致细胞死亡的“最后共同通路”［16］。CB介导的钙稳态异常与AD密切相关。CB是神经元的标志性、保护性蛋白，广泛分布于大脑皮质、海马、小脑、纹状体、黑质及周围神经系统等［17-18］。其特点是它的一级蛋白质结构具有4个EF臂能结合钙离子，CB蛋白质分子在结合钙离子前后，其构象由无活性状态变为活性状态，对钙离子具有高亲和性，进而参与一系列细胞内生理、生化过程。有研究表明，在特定脑区，衰老和AD患者中CB水平降低，对神经元内钙的缓冲能力降低，导致AD中钙介导的细胞毒性效应［19-20］。

CEGI注射液是由多种神经节苷脂、多肽、氨基酸、核酸组成的复方制剂，含有丰富的神经节苷脂（GM1、GD1a、GD1b、GT1b等）和天然生物活性多肽，具有神经修与再生、神经保护、营养与供能等作用，与神经细胞生长、发育、可塑性及学习记忆等高级神经功能密切相关，能促进受损中枢及周围神经组织的功能恢复。CEGI已在临床上用于AD的治疗，但其机制尚不清楚，特别是利用国际公认的APPswe/PS1dE9双转基因小鼠模型研究CEGI的作用机制未见报道。

本实验观察到，APPswe/PS1dE9双转基因小鼠在每日给予Tg + CEGI-L、Tg + CEGI-H 1个月后，其空间学习和记忆能力均较Tg组明显改善。在Tg + CEGI-L组，小鼠海马CA1区的神经元标志性蛋白、具有缓冲细胞内钙离子的CB表达显著增加，说明CEGI注射液对APPswe/PS1dE9双转基因小鼠的大脑皮质神经元有保护和营养作用，其机制可能通过与NMDA受体相互作用，有效拮抗兴奋性氨基酸对脑组织的毒性作用，如抑制细胞内钙离子超载，从而减少Aβ42在大脑中的聚集沉积，并且通过过表达CB以调节细胞内钙离子的浓度，减少细胞内钙超载，降低钙依赖性蛋白激酶的激活，减少氧自由基的生成，降低神经元损伤，进而改善AD认知功能。在Tg + Donepezil组，大脑皮质Aβ42老年斑的数目也显著减少，Donepezil虽属于胆碱酯酶抑制剂［21］，不直接降解Aβ42，但也可能通过拮抗NMDA受体，减少由其引起的细胞内钙超载，进而减轻由NMDA诱发的神经元损伤，减少神经元的死亡，发挥其对神经元的保护作用。综上，我们利用APPswe/PS1dE9双转基因小鼠AD小鼠模型，观察了CEGI对AD的神经保护作用，然而深入机制还不十分清楚，CEGI对Aβ42抑制作用，对过表达CB的具体作用靶点和途径还有待于进一步探讨。

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Effect of cattle encephalon glycoside and ignotin injection on expression of amyloid β-peptide 42 and calbindin-D28k in APPswe /PS1dE9 transgenic mice

HU Yazhuo1， GAO Ya1， HAN Zhitao1， XIA Zheng1， GENG Yan1， LI Ruisheng2， CHEN Hongyan1， WANG Jianhua1， ZHANG Honghong1， WANG Luning1
1Institute of Geriatrics， Beijing Key Laborarory of Normal Aging and Geriatrics， Chinese PLA General Hospital， Beijing 100853，China；2Experimental Animal Center， Chinese PLA 302 Hospital， Beijing 100039， China
Corresponding author: ZHANG Honghong. Email: zhanghh301@sina.com； WANG Luning. Email: lnw_301@163.com

Objective To observe the effect of cattle encephalon glycoside and ignotin injection （CEGI） on expression of amyloid β-peptide （Aβ42） and calbindin-D28k （CB） in brain of APPswe /PS1dE9 double transgenic mice， and investigate its prevention and treatment for Alzheimer's disease. Methods A total of 48 male homozygous APPswe/PS1dE9 double transgenic mice were randomly divided into four groups， 12 in each group: low-dose CEGI group （Tg+CEGI-L； intraperitoneal injection of 6.6 ml/ （kg·d）CEGI）， high-dose CEGI group （Tg+CEGI-H； intraperitoneal injection of 13.2 ml/ （kg·d） CEGI）， positive control Donepezil group（Tg+Donepezil； intragastric administration of 2 mg/ （kg·d） Donepezil）， Tg group （intraperitoneal injection of equal volume of 0.9% saline）. Another 12 non-transgenic （nTg） wild-type littermates were served as normal control group （nTg， intraperitoneal injection of equal volume of 0.9% saline）. After one month of drug administration， Morris water maze test was used to assess the ability of learning and memory of the mice， and the changes of expression of Aβ42 in cortex were detected by Thioflavin-S and immunohistochemistry， respectively， and the changes of expression of CB in CA1 and CA3 hippocampal region were detected by immunohistochemistry. Results Compared with Tg group， the ability of learning and memory of mice in Tg+CEGI-L group improved significantly （P＜0. 05）. The expression of Aβ42 in the cortex in Tg+CEGI-L group and Tg+CEGI-H group was significantly lower than that of Tg group （43.00±10.03 vs 24.63±10.61， 24.89± 6.81， all P＜0.05）. The expression of CB in CA1 and CA3 hippocampal region was higher in Tg+CEGI-L group than in Tg group （0.056±0.023 vs 0.031±0.001， P＜0.05）. Conclusion CEGI can reduce the expression of Aβ42 in the cortex and increase the expression of CB in CA1 hippocampal regionin APPswe /PS1dE9 double transgenic mice and improve their ability of learning and memory.

cattle encephalon glycoside and ignotin injection； Alzheimer's disease； APPswe/PS1dE9 transgenic mice； amyloid β-peptide 42； calbindin-D28k

R 977.6

A

2095-5227（2015）07-0738-06

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.07.026

2015-03-17

胡亚卓，女，学士，主管技师。研究方向：老年退行性疾病分子病理研究。Email: huyazhuo301@aliyun.com；共同第一作者：高雅，女，硕士。研究方向：老年期痴呆。Email: elegance86@163.com

张红红，女，硕士，研究员，硕士生导师，副所长。Email: zhanghh301@sina.com；王鲁宁，女，硕士，主任医师，教授，博士生导师。Email: lnw_301@163.com