白色念珠菌菌丝形成与黏附侵袭致病的调控机制研究

周文婷，李琛妍，黄凯黎，董蕙华，黄雯，黄衍强，黄干荣

(右江民族医学院，广西高校耐药微生物感染防治研究重点实验室，广西 百色 533000)

白色念珠菌通常以酵母形态作为良性共生菌生活在哺乳动物宿主中，几乎一半的人群携带有该菌，在免疫缺陷的人群中发病率最高，可由条件致病菌转为致病菌，在血流中传播，引起广泛的黏膜和全身感染性疾病[1]，死亡率高达30%～50%[2-3]。黏附、侵袭和组织损伤是白色念珠菌的主要致病过程。在该过程中，关键的毒力因素之一是菌丝形态的可塑性，即当宿主微生态平衡失调或者免疫功能受抑制时，白色念珠菌芽孢和丝状(假菌丝和真菌丝)之间可进行形态转变[4]，菌丝生长后可增强菌株的毒力。同时，菌丝形态的发生时，白色念珠菌为了抵抗巨噬细胞的吞噬作用，而利用氨基酸中和吞噬体中的酸性环境，进行了转录重编程，并通过破坏免疫细胞而逃逸[5-6]，从而使黏附、侵袭过程更容易完成。白色念珠菌菌丝形态的转变是一个高度极性化的过程。在体外菌丝诱导条件下，多种信号通路对菌丝的发育有重要的调控作用[4]，关键的调节基因包括Efg1、Cph1、Rim101和羊毛甾醇14α-去甲基化醇(lanosterol 14α-demethylase，CYP51)等[7]。它们是编码丝状形成所需的重要转录调节因子，与这些基因相反的负调控基因包括Tup1、转录调节因子(transcriptional regulator，Nrg1)和丝状生长抑制因子(repressor of filamentous growth 1，Rfg1)等，它们高表达时可明显阻止丝状生长。这种菌丝形态转变的能力受各种宿主环境条件变化的影响[8]，如温度、pH值、营养、血清及CO2等。菌丝是白色念珠菌特有的成分，菌丝壁蛋白等表面黏附素可与上皮细胞受体结合，黏附于黏膜上皮细胞，进而侵袭黏附下层，导致黏膜疾病的发生[9]，甚至扩散到其它脏器引起全身性感染。目前虽然已知菌丝的形成与菌株的致病性密切相关，但其具体的致病机制尚未完全清楚。因此，本文从菌丝形成的层面综述白色念珠菌菌丝形成与黏附、侵袭的致病调控机制，为研发新药提供靶点，增强防治白色念珠菌感染的效果。

1 白色念珠菌菌丝形成的调控机制

1.1Tup1介导的负调控通路 在Tup1介导负调控通路中通常由Tup1(转录抑制因子)、Nrg1(DNA结合蛋白)和Rfg1共同发挥作用。Tup1通过Nrg1和Rfg1靶向菌丝特异性基因。在非诱导条件下，Nrgl仍然表现为丝状生长，其缺失突变体形态类似于Tup1缺失突变体，Nrg1可以抑制由Tup1控制的菌丝调节蛋白(hyphally-regulated protein，Hyr1)、凝集素样细胞表面蛋白(agglutinin-like cell surface protein 8，Als8)、细胞伸长蛋白(extent of cell elongation protein 1，Ece1)和菌丝细胞壁蛋白(hyphal wall protein 1，Hwp1)等菌丝特异性基因的转录[10]，从而抑制丝状生长。另有实验表明，在37℃的血清中，培养诱导白色念珠菌菌丝形成时，可见Nrg1 mRNA表达减少，在诱导菌丝生长后，Nrg1通过迅速从启动子上解离，快速降低其蛋白水平，并在菌丝伸长过程中保持低水平的方式，维持菌丝的持续发育[11]。实验证明[12]，Tup1、Nrg1单缺失或双缺失的白色念珠菌菌丝形成能力大大提高，甚至不能形成酵母型细胞。此外还发现，Tup1和Nrg1可以通过对转录调节蛋白(transcriptional regulatory protein，UME6)的负调控，控制白色念珠菌的毒力和菌丝延伸[13-14]。因此，Tup1介导的负调控通路是多种转录抑制因子和DNA结合蛋白共同协同作用，其中Tup1、Nrg1和Rfg1是该通路的关键调控因子。

1.2Cph1介导的MAPK信号通路 Cph1、锌簇转录因子(zinc cluster transcription factor，Czf1)和生物膜调节剂(biofilm regulator，Brg1)等均为参与正向调控的关键因子。这些正向调控因子能够对不同丝状化途径传输的信号作出反应，或能进一步从多个途径传递信号。Cph1介导的MAPK通路是目前研究比较清楚的信号通路，在低氮环境培养白色念珠菌时，可激活MAPK信号通路从Cst20→Ste11→Hst7→Cek1传递信号，并由Cph1诱导菌丝形成。若该通路中的调控因子缺失，则抑制菌丝形成，从而降低毒力。但所有这些基因缺失的突变体在血清诱导下仍能正常形成菌丝，说明血清对菌丝形成的诱导并非完全通过MAPK信号通路完成[15]，尚有旁路进行弥补。因此，该通路的Cph1等基因并不是设计药物的理想靶基因。

1.3Efg1介导的cAMP/PKA信号通路 Efg1(丝状生长蛋白)主要通过调节菌丝形态生成和促使白色念珠菌侵入内皮细胞来促进毒力。它介导的cAMP-PKA通路，是由腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，Cyr1)以Ras依赖性和Ras非依赖性方式来整合多种线索。收到环境诱导信号后，活化的AC(腺苷酸环化酶)增加cAMP的合成，从而激活cAMP依赖性蛋白激酶调节亚基(cAMP-dependent protein kinase regulatory subunit，Bcy1)，进而激活PKA的两个催化亚基cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基(cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit，Tpk1)和cAMP依赖性蛋白激酶催化亚基(cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit，Tpk2)，二者在菌丝生长和胁迫耐受中发挥不同的作用[15]。Tpk1有助于固体培养基上的成丝，是细胞壁完整性和药物耐受性所必需的；而Tpk2则参与液体培养基中的菌丝生长，是二态性和黏附的关键调节因子[7，16-17]。它们通过磷酸化激活Efg1形成启动子，上调基因的表达诱导菌丝形成[18]。有研究表明，Efg1的表达受到5’UTR介导的翻译机制的控制。与UME6 5’UTR相反的是，Efg1 5’UTR的缺失抑制白色念珠菌的丝状形成[19]。此外，Efg1作为低氧阻遏物，其功能明显依赖于温度，其突变体在不超过35℃的温度下呈超丝状，而在37 ℃时，无论是缺氧还是常氧条件下，都无法形成菌丝[20]。可见，可以通过热效应等方法抑制Efg1介导的cAMP/PKA信号通路，从而抑制菌丝的生长。

1.4Rim101介导的pH信号通路 白色念珠菌要在体内不同部位定植、存活，就必须感知和适应细胞外pH值的变化，这种能力受pH信号转导途径的控制[21]。pH信号通路主要由Rim101介导[22]。在口咽道和血液的中性及碱性条件下，Rim101通过蛋白水解被加工成74-kDa的活性形态，有利于白色念珠菌的丝状化；在胃肠道和阴道腔的酸性环境中，则被加工成65-kDa的蛋白质[23]。此外，RIM8、RIM13和RIM20的辅助是Rim101激活过程中必不可缺的，任一的缺失都将抑制菌丝形成，从而降低白色念珠菌对上皮细胞的黏附能力[24]。但是适合白色念珠菌生长的pH值范围比较大，偏酸有利于菌丝形成，偏碱有利于孢子形成，不能从根本上抑制白色念珠菌。因此，抑制该通路只能延缓感染或降低致病毒力。

2 白色念珠菌菌丝与黏附、侵袭的致病调控机制

2.1CYP家族基因对白色念珠菌菌丝伸长和侵袭的调控 麦角甾醇是脂膜的重要组成部分，它不单能调节真菌膜的流动性、渗透性和完整性，还是细胞内多种生物学过程的重要调控因子[25]。从乙酰CoA到麦角甾醇，其生物合成过程非常复杂且高耗能，在酵母菌中，其生物合成的3个阶段分别发生在细胞内不同的位置[26-27]，如图1所示[27]。

图1 酿酒酵母中的麦角甾醇生物合成途径

CYP51是真核细胞中功能最保守的细胞色素p450单加氧酶，其介导了麦角甾醇合成的关键步骤[28]。治疗白色念珠菌病时，若CYP51(Erg11)缺失或者抑制其表达，则会抑制麦角甾醇的代谢，影响白色念珠菌菌丝伸长和侵袭性生长的能力，ROS清除缺陷，从而导致体内毒力降低。唑类药物是主要的抗真菌药物，其活性基团里含氮杂环中的氮原子通过配位键与Erg11编码的血红素铁活性中心结合来阻碍氧原子与活性中心的结合，从而抑制羊毛甾醇C-14α位的甲基羟基化反应，影响甾醇的生物合成[29-30]。甾醇的缺失又会进一步影响细胞膜功能的发挥，进而导致白色念珠菌生长受抑。此外，Erg11缺陷体能够被巨噬细胞更有效地杀死并在体内失去毒力，当Erg11p被抑制时，途径中的Erg6p、Erg25p、Erg26p、Erg27p和Erg3p等其他酶可以合成一种抑制真菌的有毒甾醇[14α-甲基麦角8-24 (28)二烯醇]，也会导致白色念珠菌的生长受抑[31-32]。因此CYP51(Erg11)对膜的稳定性和功能是必需的，是唑类杀菌剂抗真菌的主要靶点，也是设计药物抑制菌丝的关键靶点。

2.2水解酶对白色念珠菌菌丝侵袭过程的调控 主动侵袭是白色念珠菌侵袭黏膜屏障的主要机制之一，通过分泌性天冬氨酸蛋白酶(secreted asparty proteinase，SAP)、磷脂酶B(phosphohpase，PLB)和脂肪酶等各种水解酶破坏上皮细胞的结构形成通道，进而延长菌丝促使菌株侵袭黏膜屏障[33]。Sap的高蛋白水解酶活性能够降解多种宿主细胞黏膜表面的保护分子，为白色念珠菌生长提供营养[13]，同时通过增强其黏附和入侵的能力，促进白色念珠菌对宿主组织的侵袭和免疫逃逸[19]。Sap由10个Sap基因编码，机体免疫功能越低时，白色念珠菌分泌Sap的能力则越强[34]。Sap在酵母相和菌丝相间存在差异性表达，如Sap1-3主要表达于酵母相与白-灰表型转换期，而酵母型与菌丝状的转变则主要通过Efg1调节Sap4-6的表达[35]。ABIRAMI G等[36]证实了，Sap1、Sap2与生物膜的形成、磷脂酶和胞外多聚物的产生有关。Sap9与Sap10介导生物膜的形成，并在白色念珠菌细胞壁完整性以及与人类上皮细胞和中性粒细胞的相互作用中发挥作用[37]。此外，Sap9还参与白色念珠菌芽管的生成，促使中性粒细胞趋化到菌丝，通过EFG1介导的cAMP-PKA途径对血清菌丝诱导刺激作出反应[38]。PLB的水解酶和溶血磷脂酶一转酰基酶活性可以分解宿主细胞膜磷脂，引起膜通透性的增高和完整性的损伤，促使白色念珠菌侵入，但是电镜下观察到磷脂酶B缺陷型菌株和野生菌株对上皮细胞的黏附性无明显差异[39]，因此，磷脂酶B仅与宿主细胞膜的损伤有关，与黏附力无直接作用关系[40-41]。可见，在水解酶中，能作为药物靶点的可能主要是Sap。

2.3细胞壁蛋白对白色念珠菌菌丝黏附过程的调控 白色念珠菌侵袭黏膜屏障的另一主要机制是诱导内吞[33]。在黏附过程中，白色念珠菌表达了大量的细胞壁蛋白，包括黏附素和菌丝壁蛋白。目前研究比较深入的黏附素是凝集素样序列(agglutinin-like sequence，Als)基因家族。该家族蛋白中心结构中的重复序列富含暴露于细胞表面的丝氨酸和苏氨酸，这使得该家族的蛋白大多具有黏附功能[42-43]。编码的细胞表面糖蛋白在黏附方面具有重要作用。其中，Als3编码参与白色念珠菌黏附、生物膜形成、侵袭和铁获取的多功能细胞壁表面蛋白，是唯一具有显著侵袭功能的成员[44]。PHAN Q T等[45]发现，Als3是白色念珠菌附着并损伤内皮细胞、上皮细胞和细胞外基质的关键，它以哺乳动物钙黏蛋白的分子模拟物的形式，与宿主细胞中的E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白结合，刺激肌动蛋白介导的生物体内吞作用，促进白色念珠菌入侵内皮细胞和口腔上皮细胞。此外，它还作为铁蛋白受体促进铁的获取，利于白色念珠菌在宿主中的生存[44]。Als3作为菌丝特异性基因，由Tup1、Nrg1和Rfg1(菌丝特异性抑制因子)下调其转录，诱导菌丝形成的两个转录因子Efg1和Cph1则与其上调有关，如图2所示。Als1和Als5也可诱导内皮细胞的内吞作用，但与钙粘蛋白的结合较为弱[46]。

图2 Als3表达的转录调控图

具有显著抗原和菌丝特异性的Hwp1(菌丝细胞壁蛋白1)是发育调节的重要黏附素，也是菌丝发育、交配、维持生物膜完整性、附着宿主等所必需的。Hwpl通过共价连接白色念珠菌菌丝与宿主细胞，促进念珠菌的黏附，从而引起念珠菌感染[47]。另外，有研究表明，在生物膜形成过程中，Hwp1、Als1、Als3和ECE1以互补结合的方式发挥它们的作用[48-49]。可见，Als应该是汇集了其它通路的作用，是目前药物设计最为关键的靶基因。

3 总结

近年来，白色念珠菌的感染和耐药率逐步攀升，寻找和开发高效低毒的系统性治疗药物是紧急的任务。菌丝作为白色念珠菌的毒力因子逐渐成为研究的热点，其发病机制和毒力因子的关系以及毒力因子的组成非常复杂，涉及很多的理化因素和调控机制，与此相关的研究虽然越来越多，但是没有形成非常清晰的关系网络和明确的药物作用靶点。目前发现菌丝形成与翻译相关的CYP51、Sap和Als等基因可能是比较理想的药物靶基因，Tup1和Efg1等通路基因也可以作为药物靶点，但是Cph1和Rim101等基因可能不是主要的药物靶基因，是否还有更理想的药物靶基因，需要进一步探索白色念珠菌的致病机制及生长规律。