NRF2信号通路对慢性难愈合创面修复影响的研究进展

岑丽君，左远娟，唐乾利

(1. 右江民族医学院，桂西高发病防治重点实验室，广西 百色 533000；2. 广西中医药大学研究生院，广西 南宁 530001)

创面愈合是一个复杂有序的多步骤过程，多由细胞因子、生长因子和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)参与。在临床上，常将其分为4个阶段，主要是快速止血阶段、炎症阶段、增殖阶段以及重塑阶段，其中任一阶段受到干扰均可影响创面的正常愈合。当创面愈合过程受到外界干扰，且超过1个月以上的护理仍未痊愈，这就表明慢性难愈合创面的发生[1]，其多由糖尿病、压力性损伤、静脉栓塞、感染等不良因素造成，其中以糖尿病最为多见[2]。据相关报道，全球有近10亿人患有急性和慢性伤口[3]。在美国，每年用于治疗慢性伤口及其相关并发症的总成本约为500亿美元[4]。而在我国，慢性创面病人占临床外科长期住院病人总数的1.5%～3%，并呈逐年上升趋势，其中仅糖尿病性溃疡的发病率就由10年前的低于5%上升至36%左右[5]。

目前针对该病的治疗方法有：外科清创、敷料、负压吸引、冷大气血浆、生物活性玻璃等治疗方法，这些传统的治疗方法需要严格的患者依从性，同时慢性的继发性高发，因此临床上需要彻底解决这一难题，需要开辟出一种在财务上、生理上和实践上对伤口护理环境可行的新疗法。随着细胞分子生物学的发展，又相继出现其他细胞靶向治疗方案，如干细胞的使用、生长因子和基因疗法等。这些新兴的治疗手段，靶向性强，安全有效，为进一步探索伤口修复的分子和细胞特征提供了前所未有的机会。由此可见，通过细胞分子生物学研究，将为后期临床解决慢性难愈合创面提供新的可能与方向。核因子红系-2相关因子-2(nuclear factor E2-related factor 2，NRF2)作为经典的抗氧化转录因子，大量研究证实其具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用，与各种慢性疾病密切相关[4-5]。遂笔者对NRF2信号通路在慢性难愈合创面修复过程中的影响进行综述，以期为创面修复的临床和基础研究带来新的突破口，为早日攻克慢性难愈合创面的治疗提供可靠的依据。

1 NRF2信号通路激活对创面愈合过程的影响

NRF2是Cap-n-Collar碱性亮氨酸拉链蛋白家族的成员，最初被ITOH K等发现认为是β珠蛋白基因表达的激活剂，最后被认定是细胞中氧化应激的主要传感器[6-7]。其具有7个功能域(Neh1-7)，参与调节NRF2的稳定性和转录活性(反式激活)。N端结构域负责介于NRF2和Keap1(Kelch-like ECH-associated protein1)之间低纳摩尔浓度下的相互作用，介导NRF2的稳定性和泛素化，而Neh5结构域调节NRF2的细胞定位[8-9]。Neh6结构域作为含β转导重复蛋白的结合区域则控制NRF2的Keap1非依赖性降解。Neh1结构域则与NRF2与抗氧化反应元件(anti-oxidative response element，ARE)序列结，此外，其还与UbcM2(E2泛素偶联酶)相互作用，调节NRF2蛋白稳定性[10]。Neh3结构域的C端与转录共激活剂CHD6(解旋酶DNA结合蛋白)相互作用，负责染色质重塑后ARE依赖性基因的跨式活化[11]。Neh4和Neh5是转录激活结构域，与共激活剂环状磷酸腺苷单磷酸反应性元素结合蛋白结合促进NRF2转录，同时还与核辅因子RAC3/AIB1/SRC-3相互作用增强NRF2靶向调控ARE基因表达。Neh7结构域与视黄酸X受体α相互作用，从而抑制NRF2[12]。

1.1NRF2通过氧化应激影响慢性难愈合创面愈合

1.1.1氧化应激对慢性难愈合创面的影响 氧化应激阻碍了慢性难愈合创面(如糖尿病伤口)愈合的进展[13-14]。慢性难愈合创面的氧化应激的特征是创面活性氧(ROS)产生与消除不平衡而引起ROS水平持续升高[15]。适当的氧化应激有利于细胞外基质(ECM)的产生，而高水平ROS阻碍ECM的正常合成，同时严重损害现有的ECM[16-18]。例如，H2O2可以破坏组织生长，特别是胶原蛋白的产生，从而防止伤口闭合[19]。此外，高水平的ROS可干扰TGF-β1信号传导，从而影响ECM的产生；更甚者，高水平ROS促进基质金属蛋白酶(MMP)的产生，这反过来又会影响ECM重塑。因此，靶向氧化应激可能是慢性难愈合伤口愈合的潜在有效疗法。

1.1.2NRF2信号通路对氧化应激的作用 NRF2是抗氧化基因表达的关键转录因子，主要作用是检测受伤和发炎组织中的ROS积累，并激活抗氧化防御系统。在伤口愈合过程中，ROS作为氧化损伤的主要驱动力，它使Keap1泛素化降解，并与NRF2解偶联，解偶联后的NRF2进入胞核与抗氧化反应元件(ARE)结合，启动抗氧化基因的转录[20]。此外，Keap1还能够降解NRF2的E3泛素连接酶，维持NRF2的表达量[21]。在正常生理条件下，Keap1也是一种肌动蛋白结合细胞质蛋白，与NRF2和细胞的肌动蛋白细胞骨架相互作用，将NRF2隔离在细胞质中，并促进其泛素化随后被蛋白酶体降解[22-23]。这种“系留”效应维持了氧化还原稳态的细胞保护酶和蛋白质的基础基因表达[24]。越来越多的研究表明，NRF2/Keap1是糖尿病创面治疗的重要靶点。NRF2过表达和NRF2活化剂富马酸二甲酯(DMF)通过介导的糖尿病创面的氧化应激和炎症促进创面愈合[25]。SOARES M A等[26]研究发现，使用siRNA靶向沉默Keap1的表达可上调Nrf2表达，改善氧化还原稳态，加速糖尿病组织再生至接近正常水平。

1.2NRF2通过炎症反应影响慢性难愈合创面修复

1.2.1炎症对慢性难愈合创面的影响 创面炎症是一种非特异性免疫炎症反应，它涉及一系列复杂的事件：①由病原体相关分子模式(PAMPs)介导特异性识别感染信号[27]或受损组织[28]；②损伤相关分子模式(DAMPs)作为内源性分子，可识别死亡的细胞，并与模式识别受体(PRRs)的相互作用激活免疫系统。当以上信号被成功识别后，跨膜Toll样受体(TLR)或炎症小体激活特定的免疫信号通路[核因子kappa-轻链增强子激活B(NF-κB)]。最终NF-κB与IκB解离并易位到核，上调转录过程。这些事件进一步导致级联反应的下一阶段，例如白细胞介素-1-β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等促炎细胞因子的分泌[29]。随后，这些细胞因子在损伤部位招募免疫细胞(例如单核细胞和嗜中性粒细胞)，导致ROS和氮物种(RNS)的产生，从而破坏蛋白质和DNA等大分子。在正常伤口愈合情况下，为了重新建立组织稳态，修复体会阻断进一步的中性粒细胞募集以进行伤口愈合。然而在慢性创面处均可观察到一种或多种长期存在的炎性因子[30]，使创面处于持续性炎症反应中，细胞组织损伤进一步加重，最终延迟创面的愈合。细胞因子与慢性难愈合创面密切相关，唐乾利团队前期大量研究已证实这观点[31-34]。由此可见炎症反应是创面修复的必要过程，然而过度炎症则反之。在炎症级联中实现平衡是开发伤口愈合药物的具有挑战性的任务之一。

1.2.2NRF2信号通路对NF-κB信号通路作用 B细胞的NF-κB信号通路作为炎症反应的“经典通路”，它能诱导上述炎症因子的表达转录[35]。NF-κB信号通路被氧化应激刺激时会促进NF-κB抑制蛋白(IκB)的磷酸化和降解[36]，同时产生炎症细胞因子介导NRF2/ARE系统的激活。在糖尿病创面中，NRF2通过多种机制负向控制NF-κB信号通路。首先，NRF2通过降低细胞内ROS水平来抑制氧化应激介导的NF-κB激活。此外，NRF2可防止IκBα蛋白酶降解并抑制 NF-κB的核易位。据研究发现，NRF2的激活可以防止LPS引起的亲炎细胞因子如IL-6和IL-1+的转录性调高[37]，同时NRF2还抑制下游IL-17和其他炎症因子Th1和Th17的产生[38]。在糖尿病慢性难愈合创面中维格列汀通过抑制炎症标志物TNF-α、IL-6 、激活NRF2发挥其潜能，促进创面愈合[39]。在人类脐静脉内皮细胞实验发现[40]，NRF2可通过上调HO-1表达，抑制TNF-α刺激NF-κB和MCP-1的分泌[41]。这些结果揭示，当有炎症的刺激时，NRF2信号被激活，抑制了亲炎细胞因子和化疗因子的过度生产，同时限制了NF-κB的激活。

2 NRF2缺乏症对慢性难愈合创面的影响

前面已经讲述了NRF2激活对伤口愈合的影响，当前对于伤口愈合中NRF2的缺乏也得到了深入的研究。研究表明，NRF2敲除(KO)小鼠对化学诱导的癌症变化敏感，这表明NRF2可以在一定程度上限制癌症的发展[42-43]。另一方面，NRF2在许多不同类型的肿瘤中过度表达，并且与癌症预后不良有关(包括促进癌细胞增殖和增加癌细胞对化疗药物的抵抗力)[44-45]。因此，本课题组认为NRF2抑制剂可能使抗癌疗法更有效和敏感。然而，由于NRF2的抑制机制未知和较弱的特异性，要使它从实验室转向临床使用还需要很长时间。

关于NRF2抑制剂在伤口愈合过程中的应用，BRAUN S等[46]观察到，NRF2 KO小鼠伤口处的胶原蛋白产生以及巨噬细胞过度表达促炎细胞因子导致伤口愈合延迟。一般来说，dNRF2突变体可以在细胞核中聚集并与ARES(抗氧化反应元件)结合，而不会促进转录，该特征可以防止其他转录因子与AREs结合，从而有效避免了NRF2缺失引起的补偿。然而，一项研究发现，角质形成细胞特异性dnNRF2突变小鼠在正常皮肤和伤口愈合过程中没有显著差异[47]。NRF2在不同的细胞和不同的环境中可能具有不同的功能，面临不同程度的环境影响，具有不同的靶基因[48-49]。HIEBERT P等[50]发现，在体外显示缺乏NRF2的皮肤成纤维细胞表现出ROS水平略有增加，而与对照组相比，其增殖和伤口愈合动力学没有观察到差异。因此得出结论，NRF2在伤口愈合中起着特定的作用。NRF2缺乏小鼠伤口炎症时间延长，表明NRF2缺乏可能对免疫细胞的募集有一定的影响[46]。髓系免疫细胞在伤口愈合中具有关键的作用，因为其可以抵抗入侵的细菌并且通过产生ROS来产生促进愈合的因子[51]。虽然在野生型小鼠的伤口中仅检测到少量NRF2，但其细胞保护靶基因NQO-1在巨噬细胞和嗜中性粒细胞中强烈表达。将骨髓特异性NRF2 KO小鼠切片，并对伤口进行组织学免疫，细胞定量分析显示伤口愈合无明显差异[50]。虽然NRF2在伤口愈合中可能起着重要作用，但其对于正常愈合健康小鼠的伤口愈合可能不是必需的，只有在慢性难愈合伤口或瘢痕形成等病理性伤口愈合后期有影响。

3 总结与展望

慢性难愈合创面病因复杂多变，患病率逐年上涨，尽管近年来对它的研究取得了重大的进展，但是目前仍无实际的治疗方针。NRF2信号通路作为氧化应激途径突出的分子，其可抑制创面处ROS的产生从而起到细胞保护作用，同时还可调控多个炎症因子及炎症通路的基因表达介导炎症反应最终影响创面修复进程。正常伤口愈合过程中NRF2不是必须的，但是在促进慢性难愈合创面愈合是不可或缺的，在糖尿病引起的难愈合创面研究中就证实了这一论点[52]。这些发现证明了NRF2在组织修复过程中的多方面作用，同时可能揭示慢性难愈合创面某些重要的机制。然而，多项研究中也表明NRF2信号通路激活在癌症中作用是双重的，其在抗癌中的作用仍然存在巨大争议，因此，临床上使用NRF2活化化合物对伤口进行生殖作用前，应该全面考虑其他潜在的有害活性。这些活化化合物的应用应限于较短的治期，并排除伤口部位恶性肿瘤的患者。由于不同环境下NRF2的激活可导致不同的结果，因此未来在揭示NRF2的有益与有害作用以及相关靶基因及其调控的鉴定的工作将特别重要。只有多纬度了解这些不同点，安全有效的NRF2激活剂才能被开发出来。NRF2信号通路的激活和抑制对慢性伤口愈合具有多方面的影响，对其深入研究，可为伤口愈合的临床研究提供可靠的理论支持。