龙血竭总黄酮预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠细胞焦亡的影响

黄兰松，刘燕，黄表华，周柳芳，张倬华，黄照河

(1. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000)

缺血性心脏病(ischemic heart disease，IHD)是导致心血管疾病死亡率上升的主要原因[1]。急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是由冠状动脉粥样硬化斑块破裂引起的最严重的IHD。虽然及时恢复缺血心肌的血供能挽救濒死心肌，血流恢复有时反而造成更为严重的心肌损伤，即心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)，多发生于ST段抬高型心肌梗死患者[2]。由于AMI的高发病率和致死率，避免AMI患者血流再通时出现MIRI已经成为研究的重点，临床上迫切需要寻求有效减轻MIRI的策略。

细胞焦亡是近几年新发现的一种程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)，其特征是细胞膜孔隙形成，细胞内外渗透压失衡，细胞最终胀破，释放促炎细胞因子IL-1β、IL-18及细胞内容物，导致强烈炎症反应。Caspase-3/GSDME是细胞焦亡分子途径之一，当caspase-3/GSDME信号通路被激活时会导致心肌细胞焦亡[3]，但是caspase-3/GSDME介导的细胞焦亡是否参与MIRI的发生发展及其具体调控机制，目前少见文献报道。

龙血竭系百合科植物剑叶龙血树[Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen]的含脂木材经乙醇提取得到的树脂[4]。龙血竭主要含有黄酮类、有机酸、酯类、酚类和挥发油等成分，其中主要活性成分是黄酮类和酚类。龙血竭总黄酮(sanguis draconis flavones，SDF)是从龙血竭中提取的黄酮类化合物。研究表明SDF对心肌缺血有较好的保护作用[5]，但是SDF对MIRI的保护机制仍有待进一步阐明。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SD大鼠[清洁级，24只，8周龄，(250±20) g]，购自长沙市天勤生物技术有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-0014，饲养于右江民族医学院实验动物中心(NO.SYXK 2017-0004)动物房。动物房内12 h光亮/12 h黑暗交替，实验动物饲养房室内相对湿度为45%～60%，温度为22～25 ℃，实验动物自由摄取食物和水。实验流程严格遵守动物实验中心的要求和使用指南。实验研究取得右江民族医学院实验动物伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂 SDF，红棕色粉末(桂林三金制药厂)，临用前用0.5%羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)溶液配置成浓度为18 mg/mL的SDF混悬液；羧甲基纤维素钠(上海源叶)；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-Triphenyl Tetrazolium Chloride ，TTC)试剂盒(北京雷根)；TUNEL凋亡检测试剂盒(上海碧云天)；Trizol试剂盒(上海碧云天)；cDNA第一链合成试剂盒(莫纳生物)；SYBR Green qPCR Mix试剂盒(莫纳生物)；PCR引物合成(上海生工)。

1.2 实验动物分组与MIRI模型建立

1.2.1 实验动物分组 将24只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为4组，每组6只：Control组、Sham组、I/R组、SDF组。SDF组给予浓度为18 mg/mL的SDF混悬液按180 mg/kg剂量灌胃预处理[6]，每天1次，连续14 d，Sham组和I/R组给予等体积0.5% CMC-Na溶液灌胃，每天1次，连续14 d，Control组给予正常饮食不做任何干预。第14天后，建立I/R组和SDF组大鼠MIRI模型。

1.2.2 大鼠MIRI模型建立 参照SHEN S C等[7]文献建立MIRI模型，根据SD大鼠体重给予腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)进行麻醉，然后进行气管切开，连接小型动物呼吸机(潮气量为15 mL/kg，呼吸频率为70次/分)，打开大鼠胸腔，小心暴露心脏。用6-0针带线结扎LAD引起心肌缺血，观察心电图肢体导联Ⅱ导联ST段明显抬高，认为手术成功。缺血30 min后，松开线结，再灌注120 min。Sham组行相同手术操作，但不结扎LAD。

1.3 标本采集与检测

1.3.1 血清CK-MB及LDH检测 再灌注120 min后，从大鼠腹主动脉采集全血，室温放置60 min，离心(3 500 r/min，4 ℃，15 min)，收集上层血清，采用日立7600 Series全自动生化分析仪检测血清中CK-MB及LDH水平，评估心肌损伤程度。

1.3.2 心肌组织病理学染色 快速取出心肌组织，置于4%多聚甲醛中，48 h后，包埋石蜡，切成4 μm切片。切片按标准程序用苏木精和伊红染色。用400倍的光学显微镜(OLYMPUS，日本)观察并拍照。

1.3.3 心肌梗死面积检测 再灌注120 min后，用10%水合氯醛麻醉大鼠，取出心脏，20 ℃快速冷冻30 min，然后在心脏结扎处下方均匀切成5片，放在2% TTC溶液中孵育30 min。梗死组织呈白色，非梗死组织呈红色。采用数码相机(尼康，日本)拍摄，采用Image Pro Plus 6.0软件分析梗死面积。

1.3.4 心肌组织TUNEL染色 石蜡切片脱蜡，滴加蛋白酶K，37 ℃孵育20 min，PBS洗涤，滴加TUNEL检测液，37 ℃避光孵育60 min，PBS洗涤3次，每次5 min，滴加DAPI染液，室温避光孵育10 min，PBS洗涤，滴加抗荧光淬灭液封片液封片，在荧光显微镜(OLYMPUS，日本)下拍照观察。TUNEL阳性细胞数目与总细胞数目的比值百分比即为 TUNEL阳性细胞率。

1.3.5 RT-qPCR试验 采用Trizol试剂盒从匀浆后的心脏组织中提取总RNA，采用微量紫外分光光度计测定总RNA浓度。使用逆转录试剂盒将总RNA(1 μg)反转录为cDNA。使用SYBR Green qPCR Mix试剂在qPCR仪器(Light Cycler 9600，德国罗氏)扩增样本中cDNA。扩增条件如下：95 ℃预变性30 s，然后95 ℃变性10 s，65 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，循环40次。GAPDH作为内参。本研究caspase-3、GSDME、IL-1β使用的引物由中国上海生工公司设计合成，用于扩增的引物序列见表1。采用2-△△CT法进行分析。

表1 RT-qPCR引物序列

2 结果

2.1 SDF预处理降低MIRI大鼠血清中CK-MB及LDH水平 与Control组、Sham组相比，I/R组大鼠血清中CK-MB、LDH水平明显升高(P<0.01)；与I/R组相比，SDF组大鼠血清中CK-MB、LDH水平明显降低(P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠血清中CK-MB及LDH水平的比较 单位：U/L

2.2 SDF预处理能减轻MIRI大鼠心肌损伤 HE染色结果显示，Control组和Sham组大鼠心肌组织排列整齐紧密，未见炎症细胞渗出；I/R组细胞核丢失，心肌组织排列紊乱，心肌纤维明显断裂，可见较多炎症细胞渗出；而SDF预处理可以减轻这些变化，SDF组大鼠心肌细胞核丢失减少，心肌梗死区心肌组织紊乱程度减轻，心肌纤维间隙炎症细胞渗出减少。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织HE染色(×400)

2.3 SDF预处理能减小MIRI大鼠心肌梗死面积 TTC染色具有代表性的心脏切片如图2A所示，心肌组织中白色区域为梗死区域。如图2B所示，与Control组、Sham组相比，I/R组大鼠心肌梗死面积明显增大(P<0.01)；与I/R组大鼠相比，SDF预处理后MIRI大鼠心肌梗死面积明显减小(P<0.01)。

2.4 SDF预处理减轻MIRI大鼠心肌组织TUNEL阳性细胞率 每组随机选取3只大鼠心肌组织制成石蜡切片，进行TUNEL染色。每张切片在镜下随机挑选5个400倍视野，统计每个视野中TUNEL阳性细胞率。与Control组、Sham组相比，I/R组大鼠心肌组织TUNEL阳性细胞率明显升高(P<0.01)；与I/R组相比，SDF预处理组大鼠心肌组织TUNEL阳性细胞率明显降低(P<0.01)。见图3。

与Control组相比， *P<0.01；与Sham组相比，&P<0.01；与I/R组相比，#P<0.01。

与Control组相比， *P<0.01；与Sham组相比，&P<0.01；与I/R组相比，#P<0.01。

2.5 SDF预处理能抑制MIRI大鼠心肌组织caspase-3、GSDME及IL-1β mRNA表达水平 RT-qPCR结果显示，与Control组、Sham组相比，I/R组大鼠心肌组织caspase-3、GSDME和IL-1β mRNA表达水平明显升高(P<0.01)；与I/R组大鼠相比，SDF预处理组大鼠心肌组织caspase-3、GSDME和IL-1β mRNA表达水平降低(P<0.01)。见图4。

与Control组相比， *P<0.01；与Sham组相比，&P<0.01；与I/R组相比，#P<0.01。

3 讨论

MIRI发病机制错综复杂，目前已知机制主要包括炎症反应、活性氧产生过多、线粒体功能障碍、氧化应激损伤、钙超载等[8]。 MIRI是AMI患者预后不良的重要原因，通常导致左室射血分数下降、心力衰竭甚至死亡等预后不良事件[9]。进一步探讨MIRI的潜在机制及有效的防治策略对MIRI预后具有重要意义。

梗死面积是MIRI预后的关键决定因素，与缺血性心力衰竭后的全因死亡率和住院率密切相关[10]。梗死面积对ST段抬高型AMI患者预后具有预测价值，PCI术后1周测量梗死面积对ST段抬高型AMI患者术后2年心源性死亡密切相关，心肌梗死面积每升高1%，患者术后心源性死亡的风险增加7.5%[11]。大量心肌细胞死亡会影响心脏收缩和舒张功能，从而影响MIRI预后。MIRI时心肌细胞死亡方式主要为凋亡、坏死、焦亡以及铁死亡等，测定心肌梗死范围能反映心肌细胞死亡程度。 因此，检测心肌梗死面积对评估MIRI病情预后具有重要意义。研究证实，MIRI时心肌梗死面积增大，导致心功能下降[12]。本研究通过TTC染色检测心肌梗死面积，发现心肌I/R损伤大鼠心肌梗死面积增大，这与上述研究结果一致。

细胞焦亡诱导的炎症反应在MIRI发生发展中起重要作用[13-14]。目前研究表明细胞焦亡的分子途径主要包括：炎症小体激活caspase-1裂解GSDMD的经典焦亡途径，脂多糖刺激caspase-4/5/11裂解GSDMD的非经典焦亡途径，以及caspase-3裂解GSDME介导的细胞焦亡途径。不管何种途径，最终均通过释放促炎细胞因子和胞内容物诱导级联炎症反应发生。研究证实，MIRI时细胞焦亡导致的炎症反应加重心肌损伤，抑制细胞焦亡可以减轻MIRI[15]。 研究表明caspase-3/GSDME焦亡信号通路在化疗药物抗肿瘤治疗中发挥重要作用[16]，同时研究发现化疗药物通过激活caspase-3/GSDME信号通路导致细胞焦亡促使正常组织损伤[17-18]，是化疗药物产生不良反应的重要原因。化疗药物阿霉素通过激活caspase-3/GSDME焦亡信号通路诱导心肌细胞焦亡，敲低GSDME，阿霉素诱导的心肌损伤减轻[3]。 因此，caspase-3/GSDME信号通路的激活与心肌细胞死亡密切相关。由于细胞焦亡时伴有细胞器变形、DNA裂解和细胞核凝聚[19]，基于这些特点，细胞焦亡在TUNEL染色检测呈阳性。目前通过检测TUNEL阳性细胞率评估细胞焦亡程度已被应用于相关研究[20]。本研究通过TUNEL法检测各组大鼠心肌组织TUNEL阳性细胞率，发现I/R组大鼠心肌组织TUNEL阳性细胞率显著升高。这个结果再次证实，细胞焦亡参与MIRI发生发展。为了检测心肌I/R损伤是否激活caspase-3/GSDME信号通路，本研究使用qRT-PCR对caspase-3、GSDME mRNA表达水平进行检测，发现I/R组大鼠心肌组织caspase-3及GSDME mRNA表达水平明显上调，说明心肌I/R损伤时caspase-3/GSDME信号通路被激活。

Caspase-3/GSDME焦亡信号通路被激活时，通常伴随炎症因子IL-1β和胞内容物的释放。越来越多的研究关注促进缺血再灌注损伤的炎症介质，其中特别强调了关键参与者白细胞介素[21]。白细胞介素在促进炎症反应中扮演重要角色。经缺氧/复氧处理的大鼠心肌细胞中IL-1β含量及IL-1βmRNA表达水平明显升高[22]。有研究表明，抑制I/R诱导的心肌细胞焦亡，可以减少炎症因子IL-1β和IL-18释放，从而对心肌发挥保护作用[23]。因此，本研究进一步观察caspase-3/GSDME焦亡信号通路的激活是否促进IL-1β表达，通过RT-qPCR对心肌组织IL-1β mRNA水平进行检测，发现I/R组大鼠心肌组织促炎细胞因子IL-1β mRNA表达增加。IL-1β是白细胞介素1家族的一员，属于促炎性白细胞介素，参与介导炎症反应[24]。炎症反应是MIRI的重要病理生理机制之一，虽然在缺血期间炎症反应已经被诱导，再灌注时血流和氧气输送的恢复进一步促发炎症反应。因此，通过对心肌组织病理切片HE染色观察，发现I/R组大鼠心肌纤维断裂明显，可见较多炎症细胞渗出。以上结果说明MIRI过程中caspase-3/GSDME信号通路的激活，促进IL-1β mRNA表达上调，从而诱导炎症反应加重MIRI心肌损伤。

龙血竭总黄酮具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集等功效[25-26]，在心血管疾病治疗中具有重要药用价值。课题组前期研究表明，SDF预处理对MIRI大鼠心肌发挥良好保护作用[27]，但SDF对MIRI心肌的保护机制尚未阐明。本研究通过构建大鼠MIRI模型，探讨SDF预处理对MIRI大鼠的可能保护机制，发现与I/R组相比，SDF预处理后MIRI大鼠心肌组织损伤减轻，炎症细胞渗出减少，心肌梗死面积减小，心肌组织中caspase-3、GSDME及IL-1β mRNA较I/R组大鼠明显降低，说明SDF预处理对MIRI心肌具有保护作用，可能与抑制caspase-3/GSDME信号通路激活有关。

综上所述，本研究初步表明SDF预处理可以减轻MIRI心肌损伤程度，减轻炎症反应，其机制可能与抑制caspase-3/GSDME信号通路的激活有关，这一结果为SDF治疗MIRI提供新的实验依据。