IL-6介导M2型巨噬细胞促进肝癌HepG2细胞上皮间充质样改变

王安民，念家辉，方全，杨猛，黄佑冠，韦卿，浦涧

(1. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000)

原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一，病死率极高，在癌症死亡率排行中位列第二[1]。由于大量患者初诊时已经是晚期，错过了手术的最佳时间，且术后肿瘤复发转移率高，目前化疗是中晚期肝癌患者最主要的治疗手段。介于肿瘤微环境的存在，化疗及靶向治疗对于肝癌细胞的抑制仍然存在很大的限制。

肿瘤微环境是由成纤维细胞、免疫细胞、细胞外基质、内皮细胞、细胞因子及趋化因子等组成[2]。巨噬细胞是肿瘤微环境中最主要的免疫细胞群，而在实体瘤中巨噬细胞占的细胞比例更是高达50%[3]。巨噬细胞具有很强的异质性和可塑性，会根据肿瘤微环境的刺激从而进行特异性分化。根据分化后的功能和作用主要分为两种亚型：经典活化M1型和替代活化M2型[4]。M1型主要参与促炎反应、抗肿瘤免疫和病原体清除。M2型主要参与抗炎反应、伤口愈合和促肿瘤作用[5]。随着对肝癌肿瘤微环境的研究发现，M2型巨噬细胞会分泌大量因子来促进肝癌细胞的上皮间充质转化从而发生侵袭和转移。E-钙黏蛋白(E-Cadherin)表达的减少或缺失，同时N-钙黏蛋白(N-Cadherin)表达的升高是肝癌细胞发生上皮间充质转化的标志。在M2型分泌的众多因子中，IL-6就是其一[6]。但是M2型巨噬细胞和IL-6在肝癌细胞发生上皮细胞间充质转化(EMT)的功能需要进一步探讨。本研究发现M2型巨噬细胞可以促进肝癌细胞HepG2上皮间充质转化，并且IL-6可以介导M2型巨噬细胞促进肝癌HepG2细胞上皮间充质样改变。

1 材料与方法

1.1 材料 人单核细胞白血病THP-1(上海中科院细胞库)；人肝癌细胞HepG2( 右江民族医学院肝癌重点实验室 )；无血清培养基 RPMI-1640、胎牛血清(美国gibco 公司)；高糖培养基 DMEM、胎牛血清(美国gibco 公司)；PCR试剂盒ELISA酶联免疫吸附剂测定试剂、逆转录细胞试剂盒、IL-4、IL-13(赛默飞公司)；Transwell小室、PET膜0.4 μm(coring公司)；佛波酯PMA、IL-6抑制剂Corylifol A(MCE公司)；N-Cadherin、E-Cadherin引物合成(上海生工)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒(雅酶)；ECL化学发光试剂盒(碧云天)；内参抗体GAPDH、β-actin、E-Cadherin抗体、N-Cadherin抗体(武汉三鹰公司)；逆转录细胞试剂盒(赛默飞公司)；SYBRGreenPCR MasterMix(上海翊圣)。

1.2 细胞培养 HepG2细胞用高糖DMEM完全培养基，在37 ℃、5%CO2条件下培养。等待细胞生长达到培养瓶底部80%时，消化离心后按1∶2 进行传代培养。THP-1为悬浮细胞，用含10%胎牛血清的1640培养液在5%CO2、37 ℃饱和湿度条件下进行传代培养，静置沉淀后镜下细胞浓度在(2～4)×105进行传代培养时按1∶2或1∶3传代。

1.3 M2型巨噬细胞诱导及实验分组 THP-1细胞按照1×106浓度接种于Transwell上室，加入2 mL含有320 nm PMA的RPMI-1640完全培养液诱导24 h得到初始巨噬细胞M0。24 h后舍弃上清液，加入2 mL含有20 ng/mL IL-4、IL-13的RPMI-1640完全培养基继续诱导72 h后得到M2型巨噬细胞。此时舍弃上室培养液，换成DMEM完全培养液，并在下室接种浓度为1×105的HepG2细胞，构建成M2型巨噬细胞和HepG2细胞共培养体系。因实验需要把细胞分为两组：第一组，M2+ HepG2共培组、HepG2单独培养组。第二组，M2+ HepG2+IL-6抑制剂组、M2+HepG2+没有意义的溶媒。

1.4 RNA提取和PCR检测 利用3 mL巴氏吸管吸尽下室上清液，加入PBS清洗3遍，利用Trizol法提取RNA，进行逆转录。配制相应的反应体系用cDNA上机，设置3个平行复孔，以94 ℃ 5 min、94 ℃ 5 s、60 ℃ 10 s、72 ℃ 30 s、72 ℃ 5 min、45个循环为标准进行扩增。以GAPDH为参考，采用2-△△Ct法测定各基因相对表达量，重复实验3次。引物序列，GAPDH：上游5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3′下游5′-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3′；E-Cadherin：上游5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′下游5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′；N-Cadherin：上游5′-AGCCAACCTTAACTGAGGAGT-3′下游5′-GGCAAGTTGATTGGAGGGATG-3′。

1.5 蛋白提取和Western blot测定 共培组中舍弃上室，用3 mL巴氏吸管吸尽下室培养液，用PBS清洗两遍，最后加入1 mL PBS收集细胞与EP管中。在4 ℃离心机5000 r，离心10 min。加入60 μL RIP裂解液和蛋白酶抑制剂，4 ℃在摇床上剧烈震荡1 h。最后140 000 r，20 min，4 ℃离心收集上清。测定蛋白浓度，上样、电泳、转膜、孵育一二抗。用ECL显色试剂得到蛋白条带并用Image J软件进行灰度值计算。

1.6 ELISA试剂盒测定 IL-6表达水平，舍弃共培养组上室，用巴氏吸管吸取下室细胞上清与EP管中，按照试剂盒说明进行测定。

2 结果

2.1 M2型巨噬细胞诱导 THP-1细胞常规为圆形，半透明悬浮细胞(见图1)。按照诱导M2型巨噬细胞的公认标准在Transwell上室用含有320 nm佛波酯的1640培养基诱导THP-1细胞24 h，细胞变大变圆并且贴壁，即为原始巨噬细胞M0(见图2)，吸尽上清加入20 ng/mL IL-4及20 ng/mL IL-13 的1640培养基，继续培养72 h M0伸出大量伪足变为M2型巨噬细胞(见图3)。

图1 THP-1常规形态(×200) 图2 贴壁以后M0巨噬细胞(×200) 图3 伸出大量伪足的M2型巨噬细胞(×200)

2.2 RT-qPCR测定 用RT-qPCR测定M2+HepG2共培组、HepG2单独培养组中HepG2肝癌细胞N-Cadherin、E-Cadherin相对表达量，结果显示共培组HepG2细胞中N-Cadherin比单独培养组相对表达量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。而共培组HepG2细胞中E-Cadherin比单独培养组相对表达量显著降低(P<0.05)，见图5。

结果以n=3个独立实验的表示，*P<0.05。

结果以n=3个独立实验的表示，*P<0.05。

2.3 ELISA定量检测 ELISA分别定量检测M2+HepG2共培组、HepG2单独培养组、加IL-6抑制剂共培组、不加IL-6抑制剂共培组的IL-6含量。结果显示共培组中IL-6的含量明显高于单独培养组(P<0.01)。而加IL-6抑制剂共培组中IL-6的含量也明显低于不加抑制剂共培组，证明IL-6抑制剂抑制效果成功(P<0.01)，见图6、图7。

结果以n=3个独立实验的表示，*P<0.01。

结果以n=3个独立实验的表示，**P<0.01。

2.4 Western blot Western blot分别检测M2+HepG2共培组、HepG2单独培养组、加IL-6抑制剂共培组、不加IL-6抑制剂共培组的N-Cadherin和E-Cadherin蛋白相对表达量。结果显示共培组中N-Cadherin蛋白表达量明显高于单独培养组(P<0.01)，见图8A、图8B。而E-Cadherin蛋白表达量显著低于单独培养组(P<0.01)，见图8C、图8D。加IL-6抑制剂共培组的N-Cadherin相对表达量低于不加IL-6抑制剂组，说明IL-6可以介导M2型巨噬细胞促进HepG2肝癌细胞N-Cadherin表达升高(P<0.05)，见图8E、图8F。加IL-6抑制剂共培组的E-Cadherin相对表达量高于不加IL-6抑制剂组，说明IL-6可以介导M2型巨噬细胞使得HepG2肝癌细胞E-Cadherin表达减少(P<0.05)，见图8G、图8H。

A～D：共培组和单独培养组Western blot 检测N-Cadherin和E-Cadherin蛋白相对表达量。结果以n=3个独立实验的表示，**P<0.01，***P<0.001。E～H：共培组加入IL-6抑制剂和不加抑制剂共培组Western blot测定N-Cadherin和E-Cadherin蛋白表相对表达量。结果以n=3个独立实验的表示，*P<0.05。

3 讨论

在肿瘤微环境中，M2型巨噬细胞通过多种机制来实现肿瘤免疫抑制作用，例如直接参与T细胞抑制和凋亡，抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用等，协助肿瘤细胞完成免疫逃逸。M2型巨噬细胞还能通过各种分子机制来促进EMT，从而促进肿瘤的侵袭和转移。肿瘤血管生成被认为是肿瘤进展中极为关键的步骤。它提供了肿瘤细胞生长所必须的氧气和营养。在肝癌细胞中，M2型巨噬细胞分泌的相关因子促进了肝癌细胞的血管生成[7-8]。化疗药物在肝癌临床上的应用，基于肿瘤微环境的存在，同样面临着耐药性这一严重问题[9]。这不得不使研究者们的目光再次聚集于肿瘤本身的治疗，其中重要的一个环节就是其微环境中的肿瘤相关巨噬细胞。肿瘤相关巨噬细胞与肝细胞癌上皮间充质转化的关系密切，但是机制不明，成为亟待解决的科学问题[10-12]。

本课题组把THP-1细胞诱导为M2型巨噬细胞，研究M2型巨噬细胞与肝癌细胞EMT的关系。通过M2型巨噬细胞和肝癌细胞的共培养构建，得到M2型巨噬细胞可以促进肝癌细胞HepG2的N-Cadherin表达升高和E-Cadherin表达下降的结论。从而更加进一步说明M2型巨噬细胞可以促进肝癌细胞发生EMT。M2型巨噬细胞可以分泌很多细胞因子，其中包括IL-6从而促进肿瘤的侵袭和转移。接着本课题组选用了促炎因子IL-6，探讨它在M2型巨噬细胞和HepG2细胞之间的作用。从检测HepG2细胞上清IL-6表达水平相关实验，课题组更加证实了M2巨噬细胞可以分泌IL-6这一结论。同时从基因和蛋白水平得出结论：IL-6可以介导M2型巨噬细胞促进肝癌HepG2细胞上皮间充质样改变。

本研究阐明了M2型巨噬细胞分泌的IL-6在肝癌细胞HepG2发生EMT中的作用，揭示了M2型巨噬细胞通过分泌IL-6促进肝癌细胞HepG2上皮间充质转化，为治疗肝癌的转移提供了新思路。由于M2型巨噬细胞分泌IL-6受到很多分子通路的共同作用，具体的分子通路机制还需要进行更深入的研究。