IL-14在变应性鼻炎小鼠中表达的实验研究

李荣荣，瞿申红，张少杰，翁敬锦，黄雪颖，钟自玲，郑少川

(1. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2. 广西壮族自治区人民医院耳鼻咽喉头颈外科，广西 南宁 530021)

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是耳鼻咽喉头颈科的常见病多发病之一，是发生在鼻黏膜的慢性炎症[1]，由免疫球蛋白E介导的Ⅰ型变态反应性疾病。AR发病机制复杂，与多种免疫细胞和细胞因子密切相关[2-4]，1型辅助T细胞(type 1 helper cells，Th1)和调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)减少，2型辅助T细胞(type 2 helper cells，Th2)和17型辅助T细胞(type 17 helper cells，Th17)细胞增多，以及Th1/Th2比例降低均是AR的特征性表现[5-7]。目前已有大量研究证实在AR中Th2分泌的细胞因子IL-4、IL-5和IL-13等升高与AR临床症状呈正相关，并对AR的诊断有重要指导意义[6，8-9]，同时在靶向治疗自身免疫病、过敏性免疫紊乱性疾病中也有卓越成效。IL-14也是一种重要细胞因子，又称高分子量B细胞生长因子(high molecular weight B cell growth factor，HMW-BCGF)，主要是由T淋巴细胞产生，可诱导活化B细胞的增殖，但对静止的B细胞无刺激作用[10]，目前与IL-14有关的研究大多是自身免疫疾病和肿瘤[11]，此次研究通过动物实验，探讨在AR的发病过程中，IL-14在小鼠的血清和鼻黏膜中表达是否有改变 。

1 材料与方法

1.1 实验动物 由湖南长沙天勤生物技术有限公司(实验动物生产许可证号：SCXK湘2019-0014)提供20只5周龄的BALB/c小鼠，体重约为15～18 g，接收小鼠后饲养于广西医科大学SPF级动物实验室(实验动物生产许可证号：SCXK桂2020-0003) ，在饲养实验动物前经过正规申请及审批(实验动物使用许可证号：SYXK桂2020-0004)。 饲养条件：独立通风系统，温度控制在20～26 ℃，鼠笼及实验室相对湿度40%～70%，昼夜明暗交替时间为12 h，小鼠根据生理需求自行摄食及饮水(无菌饲料及无菌水)，由专业饲养人员进行更换鼠笼垫料、添加饲料及饮用水，SPF级实验室每周进行一次彻底的清洁消毒。

1.2 实验试剂和器材 见表1。

表1 实验试剂及耗材

1.3 实验方法

1.3.1 模型建立 饲养于SPF级的BALB/c小鼠进行分组造模，AR组和对照组各10只，分别于开始造模的第0天、第7天、第14天腹腔注射150 μL PBS+25 μL OVA+25 μL氢氧化铝和氢氧化镁混合液进行基础致敏，然后于第21～25天以1%OVA连续5 d滴鼻激发，每天1次，每侧鼻腔5 μL。对照组用等量的PBS替换进行基础致敏和激发。

1.3.2 行为学观察 在最后一次激发之后用电子称对每只小鼠进行称重并在尾部标记编号，然后双盲法观察小鼠的行为学变化，每只小鼠观察30 min，分别记录小鼠抓鼻、打喷嚏的次数。

1.3.3 内眦静脉采集及ELISA检测 在观察行为学后12 h之内用0.3%戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，然后利用真空采血针取内眦静脉血，室温静置1 h，待血液分层后离心(3 000 r/min，10 min，4 ℃)，吸取上清至干净EP管保存于-80 ℃冰箱待用，使用IgE和IL-14 ELISA试剂盒检测血清IgE和IL-14，每个标准品和样本均设置副孔，酶标仪在吸光度450 nm进行检测。

1.3.4 鼻组织切片 酒精棉球消毒小鼠胸腹部，沿肋缘做“倒V”形切口，逐层剪开皮肤、肌层，暴露膈肌，仔细分离膈肌与周围组织，保护心脏及大血管，剪开膈肌，沿着胸骨外侧做纵切口，充分暴露胸腔内的心脏、肺脏以及大血管，解剖出左心室和右心耳，眼科剪剪开右心耳，使用灌注装置从左心室进针，先用PBS灌注全身置换血液，至灌注液由鲜红血液变为无色液体，再用4%多聚甲醛灌注至全身僵硬，将小鼠断颈，剔除鼻部周围皮毛和软组织结构，仅保留小鼠鼻前部约1 cm范围内的鼻骨组织和鼻腔内黏膜等组织，加入4%多聚甲醛浸没，在4 ℃条件下过夜，次日换EDTA脱钙液浸没，隔日换液，直至第7天鼻骨组织透明、质软，再依次进行脱水、透明、包埋、切片、烘干、脱腊、HE染色及封片等处理。

1.3.5 剥离鼻黏膜及基因扩增 剥离小鼠鼻黏膜组织，运用Trizol法提取鼻黏膜RNA。首先去除基因组DNA杂质，分别加入以下试剂：5×gDNA Eraser Buffer，2.0 μL；gDNA Eraser，1.0 μL，使用基因扩增仪设置程序，条件为42 ℃ ，2 min；然后逆转录为cDNA，再加入PrimeScript RT Enzyme Mix I，1.0 μL；RT Primer Mix，1.0 μL；5×PrimeScript Buffer 2，4.0 μL；RNase Free dH2O，4.0 μL，体系中总 体积为20.0 μL，在基因扩增仪设置程序，37 ℃反应15 min，85 ℃反应5 s。然后进行扩增，配备反应体系：PCR Forward Primer和PCR Reverse Primer各0.8 μL，cDNA 模板，2.0 μL；DEPC无酶水，6.0 μL；ROX Reference Dye II(50X)，0.4 μL；TB Green Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2X)，10.0 μL，反应体系总共20.0 μL；运用实验室所配备仪器Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System设置条件进行扩增基因：①第一步进行预变性：95 ℃反应30 s，1个循环；②PCR反应：95 ℃反应5 s，60 ℃反应34 s(当进行miRNA扩增时设置为31 s)，一共40个循环；③95 ℃反应15 s，60 ℃反应1 min，95 ℃反应15 s，60 ℃反应15 s，1个循环。运用2-△△CT法统计分析AR小鼠与对照组小鼠鼻黏膜的IL-14基因表达量，此次实验所用引物，见表2。

表2 PCR所用引物序列

2 结果

2.1 小鼠行为学观察 最后一次激发后双盲法观察记录30 min内小鼠抓鼻、打喷嚏次数，AR组小鼠和对照组小鼠体重无明显差异(P>0.05)，故体重对实验指标无明显影响，两组间有可比性；抓鼻次数差异有统计学意义(P<0.01)，打喷嚏次数差异亦有统计学差异(P<0.01)，见表3。

表3 各组小鼠体重及行为学表现比较

2.2 小鼠鼻部组织病理切片 对照组鼻黏膜上皮细胞及纤毛完整，排列整齐，纤毛有节律的摆动有助于分泌物顺利排出，杯状细胞分泌黏液保持鼻黏膜湿度，镜下可见少许嗜酸性粒细胞浸润，见图1A。AR组由于过敏原的长期反复刺激，鼻黏膜发生慢性病变，鼻黏膜上皮细胞的微观结构紊乱，柱状细胞参差不齐，纤毛结构缺损紊乱，并且镜下可见大量紫红色的嗜酸性粒细胞浸润，见图1B、图1C。

图1A：对照组小鼠鼻黏膜病理切片，可见少量嗜酸性粒细胞浸润，纤毛完整，排列整齐；图1B、图1C：实验组小鼠鼻黏膜切片可见大量嗜酸性粒细胞浸润，纤毛结构紊乱、缺损，上皮细胞参差不齐。

2.3 小鼠血清IgE和IL-14浓度 根据血清IgE和IL-14浓度，计算得出每个样本浓度，利用SPSS 25.0进行正态分布检验，得出该数据酶标仪检测每个样本OD450吸光符合正态分布，行独立样本t检验统计学分析得出AR组血清的IgE平均浓度较对照组升高，差异有统计学意义(P=0.024)，如图2A所示；AR组血清的IL-14浓度亦较对照组升高，差异具有统计学意义(P=0.029)，如图2B所示。

*P<0.05。

2.4 小鼠鼻黏膜IL-14表达量 利用2-ΔΔCT(Livak)公式计算得出两组小鼠鼻黏膜中IL-14的相对表达量，可以得出AR组相比对照组小鼠鼻黏膜的IL-14基因表达量明显升高， 并且两组间差异具有统计学意义(P=0.015)，如图3所示。

*P<0.05。

3 讨论

AR是以鼻痒、喷嚏、水样涕及鼻塞等临床症状为主的一种鼻部慢性炎症[12]。随着化工业的飞速发展和人们生活习惯的改变，免疫系统疾病的发病率逐年增加[13]，AR的发病率也呈逐年增长趋势[14]，已经成为全球性的公共健康问题，严重影响患者的生活、工作和学习，不仅增加家庭负担，同时加重医疗资源的损耗[15]，儿童的免疫系统尚未发育完善，是AR的高发群体[16]。

AR的发病主要与遗传和环境密切相关。在免疫性疾病中起重要作用的是表观遗传学[17-18]，是指在不改变基因序列的碱基数量及排序的前提下，由环境因素影响后可使相关的表型遗传至下一代[15]，再者，AR本身就是与环境密切相关的疾病，使得环境与表观遗传学因素相互促进疾病的发展[18-20]。作为Ⅰ型变态反应的典型代表的AR，主要以CD4+T细胞中的Th1、Th2 、Th17和Treg亚群为主发生免疫应答[7，21]，以及IL-2和IFN-γ等典型的Th1类细胞因子[22]，代表性的Th2 类细胞因子IL-4、IL-5和IL-13等[8，23]。同时AR还激活B型淋巴细胞为浆细胞，然后合成并释放IgE[16]。

IL-14是一种主要由活化的T淋巴细胞、滤泡树突状细胞(follicular dendritic cells，FDC)和一些恶性B淋巴瘤细胞产生，对活化的B淋巴细胞有刺激作用的细胞因子[24]，IL-14是由IL-14基因正向链上的3～10外显子编码的细胞因子[10]。有研究者认为IL-14可以选择性地作用于记忆B细胞来增强免疫记忆，通过将低亲和力自身反应性转化为高亲和力记忆B细胞来诱导免疫反应[25]，有转基因小鼠实验和临床实验发现IL-14在促进抗体产生、B细胞生长和存活以及B细胞记忆中起着重要作用[26]。近年来，大量动物实验和临床实验研究发现IL-14是一种与系统性红斑狼疮、伯基特淋巴瘤以及原发性干燥综合征等自身免疫病和肿瘤疾病的特异性抗体联系紧密的细胞因子[27]。也有研究发现IL-14可以诱导IFN-α的产生，而不是IFN-γ，而IFN-α属于Ⅰ型干扰素，主要参与机体抗病毒、抗肿瘤和免疫调节过程，而IFN-γ属于Ⅱ型干扰素，IFN-γ可诱导病毒感染的细胞表达病毒抗原，增加免疫系统识别和杀伤感染细胞的能力，还可作为免疫佐剂参与机体的免疫反应，其抗病毒作用弱于Ⅰ型干扰素[28]，IFN-α在过敏性疾病、狼疮性肾炎以及肝炎等感染性疾病中，过敏性紫癜以及IFN-α过敏患者进行抗过敏治疗后症状及IgE、IL-4、IFN-α均有下降，IL-2升高[29-30]，由此推断IL-14可能通过T淋巴细胞分泌，调节B淋巴细胞活性，同时可以诱导IFN-α生成，对免疫系统疾病发挥调节和影响。

本研究认为IL-14发挥着联系T淋巴细胞和B淋巴细胞之间的桥梁作用，并且还可以诱导Ⅰ型干扰素IFN-α的生成，参与机体免疫系统的反应与调节，而AR就是一种与天然免疫和获得性免疫均相关的免疫系统疾病。本研究通过建立BALB/c小鼠AR动物实验来探究IL-14在AR中的变化趋势，通过观察小鼠抓鼻和喷嚏的行为学改变发现，AR组的过敏症状更加明显，同时，AR组的鼻黏膜组织病理学中嗜酸性粒细胞浸润数量和纤毛上皮的破坏较对照组更严重。除外这些主观性的观察之外，还进行检测小鼠血清中IgE浓度和IL-14浓度，IgE作为Ⅰ型变态反应的特异性免疫球蛋白，在AR组的小鼠血清中浓度显著高于对照组，AR组小鼠血清的IL-14的浓度相比对照组亦明显升高，IL-14在血清中的存在形式是蛋白质分子，同时在基因水平进行研究，通过扩增小鼠鼻黏膜IL-14发现，在AR组小鼠的鼻黏膜中IL-14的相对表达量较对照组增加。

因此，可以初步猜测IL-14可能是先由T淋巴细胞合成和分泌，然后IL-14激活B淋巴细胞为浆细胞，浆细胞进行分泌IgE，进而参与AR的发病过程。本实验研究初步探讨了IL-14在变应性鼻炎小鼠中的表达变化，随着近年来单克隆抗体在基础科研和检验技术中的发展和应用[31]，未来可以通过此项技术进一步探究IL-14在AR等免疫系统疾病中更深层面的作用和机制。