基于抗氧化药效成分群测定瓜蒌提取物中总黄酮的含量

孙明雪，邹纯才，鄢海燕，严国宇

(皖南医学院药学院，安徽 芜湖 241002)

瓜蒌为葫芦科植物栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim.)或双边栝楼(T.rosthorniiHarm)的干燥成熟果实，其种子和果皮分别作为瓜蒌子和瓜蒌皮入药[1]，黄酮类化合物是瓜蒌的主要化学成分之一[2]。有研究报道[3-5]黄酮类化合物具有保护胃黏膜、抗实验性胃溃疡等作用。有研究表明瓜蒌提取物(trichosanthes extract，TE)具有抗胃溃疡的作用[6-8]，而黄酮类化合物[9-10]可能是TE抗胃溃疡的活性成分[11]。课题组前期采用高效液相色谱法对TE的化学指纹图谱及TE中所含的芦丁(黄酮醇类)、木犀草素(黄酮醇类)、芹菜素(黄酮类)、异槲皮苷(黄酮醇类)和山奈酚(黄酮醇类)5种成分进行研究，结果表明TE中芦丁∶木犀草素∶芹菜素∶异槲皮苷∶山奈酚为1∶2∶1∶2∶3(质量比，以下简称芦丁等混合对照品)，见图1。并进一步考察了TE和芦丁等混合对照品的抗氧化活性[12-13]，通过谱效关系确定了TE抗氧化药效成分群。目前，有关总黄酮的含量测定，现有方法为选择某一单一对照品建立标准曲线并进行定量分析，由于单一对照品较难反映中药或中药提取物的药效，因此采用单一对照品测定总黄酮的含量与实际药效间缺少关联。为此，本文基于抗氧化药效成分群采用紫外-可见分光光度法测定TE总黄酮含量，以期为总黄酮的含量测定提供一个新思路。

1.芦丁；2.异槲皮苷；3.木犀草素；4.芹菜素；5.山奈酚。

1 实验材料

1.1 实验仪器 UV5100型紫外-可见分光光度计(日本日立公司)；AUW-220D型电子天平(日本岛津公司)；Heidolph-LR4010/4011旋转蒸发仪(德国海道尔夫公司)；pHS-3C型pH计(上海越平科学仪器有限公司)。

1.2 实验试剂 瓜蒌皮(批号：20171202)、瓜蒌子(批号：20201020)均购自河北安国御颜坊中药材有限公司；三氯化铝(批号：20150604，山东西亚化学工业有限公司)；芦丁(批号：141208)、异槲皮苷(批号：140404)、山奈酚(批号：150929)(纯度≥98.0%)均购自成都普菲德公司；木犀草素(批号：MO2-140513)、芹菜素(批号：QO2-140512)(纯度≥98.0%)均购自中药固体制剂制造技术国家工程研究中心；其余试剂为分析纯；水为纯化水(自制)。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 0.1 mol/L三氯化铝溶液 取三氯化铝1.3335 g，精密称定，用5 mL水溶解并用无水乙醇定容至100 mL量瓶中，即得。

2.1.2 乙酸钠-乙酸缓冲液的配制 取乙酸钠5.0012 g，精密称定，溶于10 mL水中，制得乙酸钠溶液，备用。精密量取5 mL冰乙酸于50 mL量瓶中，用水定容至刻度，制得10%的冰乙酸，备用。用10%冰乙酸溶液滴定乙酸钠溶液，分别配制pH=4.50、pH=5.00、pH=5.50、pH=6.00和pH=6.50的缓冲液，即得。

2.1.3 抗氧化药效成分群溶液 取芦丁10.5 mg、木犀草素10.4 mg、芹菜素10.4 mg、异槲皮苷10.6 mg、山奈酚10.5 mg，精密称定，分别置于50 mL量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，分别制成浓度为0.210 mg/mL、0.208 mg/mL、0.208 mg/mL、0.212 mg/mL、0.210 mg/mL的芦丁、木犀草素、芹菜素、异槲皮苷、山奈酚混合对照品储备液；按芦丁等混合对照品的质量比，分别精密量取芦丁、木犀草素、芹菜素、异槲皮苷、山奈酚对照品储备液适量至10 mL量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，制得浓度为36.21 μg/mL的混合对照品(每mL含芦丁、木犀草素、芹菜素、异槲皮苷、山奈酚对照品的质量合计为36.21 μg)稀释液，即抗氧化药效成分群溶液。

2.1.4 TE的制备[14]参照课题组前期提取工艺，取瓜蒌(瓜蒌皮∶瓜蒌子=2∶3)，精密称定，以70%乙醇为提取溶剂，料液比为1∶10(g/mL)，超声提取(功率200 W，超声频率40 Hz)，提取温度为40 ℃，提取次数为3次，提取时间为60分钟/次，所得滤液合并后于4 ℃静置12 h，滤除沉淀并回收溶剂制备浸膏。所得浸膏冷冻干燥48 h，得TE冻干粉。

2.1.5 TE样品溶液 取TE冻干粉10.0000 g，精密称定，用20 mL蒸馏水溶解，等量乙酸乙酯超声萃取3次，每次20 min，合并乙酸乙酯层并回收溶剂，残渣用无水乙醇定容至50 mL量瓶，备用。

2.2 总黄酮含量测定方法的建立

2.2.1 检测波长的确定和乙酸缓冲液pH值的考察 取适量的“2.1.3”项下抗氧化药效成分群溶液及“2.1.5”项下TE样品溶液，分别以无水乙醇为参比，扫描抗氧化药效成分群溶液和TE溶液显色前的光谱图；取20 μL的抗氧化药效成分群溶液和2 mL TE溶液，分别加入0.1 mol/L三氯化铝溶液和不同pH下(pH=4.50、5.00、5.50、6.00、6.50)的乙酸钠-乙酸缓冲液(V∶V∶V=1∶2∶1)，室温显色30 min，以同法处理的无水乙醇、0.1 mol/L三氯化铝溶液和乙酸钠-乙酸缓冲液为参比，扫描抗氧化药效成分群溶液和TE溶液显色后的光谱图。比较抗氧化药效成分群溶液和TE溶液显色前、后的光谱图及抗氧化药效成分群溶液和TE溶液在不同pH下显色30 min和1 h的光谱图，确定乙酸缓冲液的最佳pH值和样品的检测波长。

2.2.2 标准曲线的建立 精密量取“2.1.3”项下的抗氧化药效成分群溶液(36.21 μg/mL)0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL、0.40 mL各两份，分别置于10 mL量瓶中。其中一份用无水乙醇定容至刻度，以无水乙醇为参比，在420 nm测定吸光度，记为A1；另一份按“2.2.1”项下显色方法(pH=5.3，显色30 min)处理并在420 nm处测定吸光度A2；计算相同浓度抗氧化药效成分群溶液组的ΔA值 (ΔA=A2-A1)。以抗氧化药效成分群溶液的浓度(μg/mL)为横坐标，以ΔA为纵坐标，采用最小二乘法建立标准曲线。参照抗氧化药效成分群溶液标准曲线的建立方法，建立芦丁等5个单独对照品的标准曲线，确定其相关系数和线性范围。

2.2.3 方法学验证

2.2.3.1 精密度试验 精密量取“2.1.5”项下TE(批号：20210402)样品溶液1 mL于10 mL的量瓶中，按“2.2.2”项下方法处理，平行测定5次，记录ΔA值。

2.2.3.2 重复性试验 取TE(批号：20210402)，按“2.1.5”项下TE样品溶液方法制备溶液5份，按“2.2.2”项下方法处理，记录ΔA值。

2.2.3.3 稳定性试验 精密量取“2.1.5”项下TE(批号：20210402)样品溶液1 mL同一样品溶液于10 mL的量瓶中，按“2.2.2”项下方法处理，分别于0 min、15 min、30 min、45 min、60 min测定，记录ΔA值。

2.2.3.4 加样回收试验 精密吸取1.0 mL的已知总黄酮含量的TE(批号：20210402)样品溶液9份，分别精密量取适量的抗氧化药效成分群溶液置于样品溶液中(抗氧化药效成分群质量分别为所取样品溶液中总黄酮质量的80%、100%和120%，各3份)，按 “2.2.2”项下方法处理，平行测定3次，记录ΔA值，计算样品加样回收率。

2.3 TE总黄酮的含量测定[9，15]取TE(批号：20210402、20210403、20210405)，按“2.1.5”项下方法制备TE样品溶液。精密量取1.0 mL TE样品溶液，置于10 mL量瓶中，按 “2.2.2”项下方法处理，计算TE样品溶液ΔA值 (ΔA=A2-A1)，采用抗氧化药效成分群标准曲线和芦丁等5个单独对照品的标准曲线，分别测定TE中总黄酮的含量。

2.4 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学处理。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 检测波长的确定及缓冲液pH值的考察结果分析 按“2.2.1”项下方法，在不同pH值乙酸缓冲液下，通过扫描抗氧化药效成分群溶液和TE溶液在300～700 nm处的紫外-可见光谱图，发现抗氧化药效成分群和TE溶液显色后均在420 nm处存在最大吸收峰，故可确定测定波长为420 nm。但TE显色前在420 nm波长也有吸收，因此不能采用紫外-可见分光光度法直接测定TE显色后的吸光度来计算总黄酮的含量[14]。可采用差示分光光度法于420 nm波长处测定TE中的总黄酮含量，见图2。同时研究还发现，TE和抗氧化药效成分群显色前后的吸光度差值随pH值的增大而增大，见图3。

A：抗氧化药效成分群显色前后光谱图；B：TE显色前后光谱图；C：样品和抗氧化药效成分群显色后光谱图；D：TE差示光谱图。

A：TE在不同pH值下显色30 min和1 h的光谱图；B：抗氧化药效成分群在不同pH值下显色30 min和1 h的光谱图。

由图3可知，TE显色后放置30 min和1 h的曲线在pH=5.3处有交点，即ΔA值是相等的，可消除放置时间波动对测定结果的影响；同时在pH=5.3±0.2范围内，显色后放置30 min时，TE和抗氧化药效成分群的ΔA值近似为一平行于横坐标的直线，即在pH=5.3±0.2范围，ΔA值基本不变，可消除因pH波动对测定结果的影响，故选择pH=5.3的乙酸缓冲液来控制显色后溶液的pH。

3.2 标准曲线的确定结果分析 按“2.2.2”项下方法，以ΔA为纵坐标，抗氧化药效成分群溶液稀释液的浓度(μg/mL)为横坐标建立标准曲线，回归方程为ΔA=0.2324C-0.0107，r=0.9995，结果表明抗氧化药效成分群在0.18～1.45 μg/mL的范围内线性关系良好。

3.3 方法学验证结果

3.3.1 精密度 按“2.2.3.1”项下方法， 5次测定ΔA值的RSD值为0.3%，表明方法精密度良好。

3.3.2 重复性 按“2.2.3.2”项下方法，5份溶液测定ΔA值的RSD值为3.4%，表明方法重复性良好。

3.3.3 稳定性 按“2.2.3.3”项下方法，样品显色后分别放置0 min、15 min、30 min、45 min、60 min测定ΔA值的RSD值为3.5%，表明样品在显色后60 min内稳定。

3.3.4 回收率 按“2.2.3.4”项下方法，计算回收率，结果见表1。由表1可知，加样回收率试验9次测定结果的均值为97.81%， RSD为1.68%，表明方法准确度较好。

表1 加样回收率结果

3.4 TE中总黄酮的含量测定 按“2.2”项下的方法测定TE中总黄酮的含量，并与采用单独对照品(芦丁、木犀草素、芹菜素、异槲皮苷、山奈酚)建立标准曲线测定TE中总黄酮的含量结果作比较，结果见表2 。由表2可知，选择的对照品不同，计算出的TE中总黄酮的含量也不同。与抗氧化药效成分群组相比较，采用单一对照品如芦丁、木犀草素等测得的TE中总黄酮含量均较高且有显著性差异(P<0.01)。

表2 不同对照品标准曲线测定的TE总黄酮含量测定结果

表2(续) 不同对照品标准曲线测定的TE总黄酮含量测定结果

4 讨论