基于网络药理学分析三七总皂苷通过外泌体miR-21干预缺血性脑卒中作用机制

欧阳扬，刘佩，刘玥彤，杨鎏鑫，黄清，刘蕾，陈维，陈玉珍，方子文，蒙兰青

(1. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000；3. 粤北人民医院，广东 韶关 512000)

脑卒中是世界范围内死亡和残疾的主要原因之一，其两大分类是缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中占80%以上[1-2]。全世界每年大约有1 500万人患中风，500万长期残疾，严重威胁人类生命安全和生活质量[3]。缺血再灌注损伤是缺血性脑卒中的主要病理过程，其特征是炎症损伤、氧化损伤和凋亡[4]。有研究表明[5]，三七的提取物三七总皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)能通过多靶点多途径干预缺血再灌注损伤过程，是近年防治缺血性脑卒中的研究热点。

外泌体是在细胞内囊泡与质膜融合后分泌到细胞外环境中的40～100 nm微泡，主要携带蛋白质、mRNA和miRNA等小分子物质[6]，通过胞吐作用从细胞中释放，受体细胞摄取外泌体后发挥相应生物学效应[7]。有研究表明，外泌体携带的多种miRNA可以减轻脑缺血再灌注损伤，具有治疗缺血性脑卒中的潜力[8-9]。miRNA是长度约为22个核苷酸的非编码小RNA，通过抑制下游靶基因发挥生物学功能，在多种生物过程中发挥重要作用[10]。现有研究表明[11]，miR-21对缺血再灌注损伤的神经具有保护作用，然而，外泌体miR-21与三七总皂苷在缺血性脑卒中的治疗相关机制尚未完全明确。

本研究使用生物信息学方法、网络药理学及分子对接研究外泌体miR-21和三七总皂苷共同靶点在治疗缺血性脑卒中作用，可能会增加对缺血再灌注损伤理解，并有助于开发缺血性脑卒中的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 筛选缺血性脑卒中的相关基因 在Genecard数据库(http：//www.genecards.org)和DisGeNet数据库(https：//www.disgenet.org/)使用关键词缺血性脑卒中(ischemic stroke，IS)、脑梗塞(cerebralinfarction)、脑缺血(cerebralischemia)查询与缺血性脑卒中相关的基因，合并查询到的靶基因，并删除重复项。

1.2 外泌体miR-21的靶基因预测 外泌体miR-21的靶基因由mirnet在线工具(https：//www.mirnet.ca/)及外泌体数据库EVmiRNA(http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/)检索得到。在mirnet中，以关键词“has-mir-21”进行预测，物种选择“human”，组织来源选择“exosome”，靶基因数据库选择“miRTarBase V8.0”、“TarBase”，“miRecods”。在EVmiRNA中，输入miR-21，查询相应的靶基因。将上述二者查询到的靶基因合并后去除重复项。

1.3 三七主要活性成分的筛选和靶点预测 在TCMIP(http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/)和BATMAN-TCM数据库(http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php，cutoff=20、Adjusted P-value<0.05)中，以“SANQI”作为关键检索词，筛选三七总皂苷的活性化合物。将两个数据库得到的三七总皂苷活性化合物取交集，得到12个三七总皂苷活性化合物。

为了得到三七总皂苷活性化合物的作用靶点，从PubChem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中获取了三七活性化合物的简化分子输入线输入规范(SMILES)信息，将SMILES信息导入SwissTargetPrediction平台(http：//www.swisstargetprediction.ch/)[12]，属性设置为“Homo sapiens”，筛选结合概率≥0的三七活性化合物基因靶标。

1.4 蛋白质相互作用网络的建立及核心基因筛选 将三七总皂苷活性化合物靶基因、缺血性脑卒中靶基因、外泌体miR-21靶基因分别上传到在线维恩图中，以获取它们的共同基因。使用CytoScape软件(version 3.9.0)的STRING插件对共同基因构建蛋白互作网络，物种设置为“Homo sapiens”，置信水平设置为≥0.4，删除无连接的靶点。最后通过Cytohubba插件进行关键靶点分析，筛选前10基因为核心基因。

1.5 GO和KEGG富集分析 使用在线工具DAVID对47个共同基因进行基因本体(Gene Ontology，GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)途径分析，物种设置为“Homo sapiens”。

1.6 活性化合物-靶基因-信号通路网络建立 将三七活性化合物及预测到的靶基因、缺血性脑卒中靶基因、miR-21靶基因及关键信号通路导入Cytoscape软件，构建“三七总皂苷活性成分-靶基因-信号通路”网络。

1.7 分子对接 鉴于生物活性分子的靶点筛选尚无统一标准，因此选择PPI网络度最高的5个靶基因与三七总皂苷的活性分子进行分子对接。使用在线工具CB-Dock (http：//clab.labshare.cn/cb-dock/php/blinddock.php)进行分子对接，最后选择结合能最低的对接模型进行可视化。

2 结果

2.1 活性成分和共同调控基因分析 从Genecard和DisGeNet数据库中共获得10 244个缺血性脑卒中相关基因。从BATMAN-TCM和TCMIP数据库中查询到的三七总皂苷共有活性化合物为12个(见表1)，通过SwsisTargetPrediction平台得到223个活性化合物作用的靶基因。在EVmiRNA数据库查询到的1 667个has-mir-21-5p的靶基因，在mir2gene数据库中，has-mir-21的靶基因为48个，has-mir-21-3p的靶基因为1 670个，has-mir-21-5p的靶基因为1 735个。通过绘制韦恩图将上述过程可视化(见图1)，得到47个共同基因。

表1 三七总皂苷12种主要成分信息

A：共同靶点韦恩图； B：筛选活性成分韦恩图；C：缺血性脑卒中靶点韦恩图； D：外泌体miR-21靶点韦恩图。

2.2 GO和KEGG分析 使用在线工具DAVID对47个共同靶基因进行GO和KEGG富集分析，以P≤0.05，Q≤0.05为标准筛选。结果如图2显示，在生物过程中，靶基因主要富集在凋亡过程的负调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、细胞增殖的正调控等项目。在细胞组分中，主要富集在蛋白复合体、膜筏、核染色质、细胞膜、胞液等项目。在细胞功能中，主要富集在蛋白激酶结合、转录因子结合、蛋白结合、类固醇激素受体活性、酶结合等项目。KEGG分析表明，共同基因主要参与癌症中的蛋白聚糖、HIF-1信号通路、胰脏癌、肿瘤坏死因子信号通路等通路。

A：生物过程富集图；B：细胞组分富集图；C：细胞功能富集图；D：KEGG富集图。

2.3 PPI网络构建及核心基因分析 使用Cytoscape的STRING插件，对47个靶基因进行PPI网络构建，计算靶基因在PPI网络中的度值(Degree)，cutoff>0.4，忽略与主网络无连接点的靶点，最终得到41个节点，235条边的PPI网络(见图3)。使用Cytohubba插件中的MCC算法对PPI网络进行计算，得到属于前10的核心基因为CASP3、EGFR、VEGFA、STAT3、HIF1A、ESR1、BCL2L1、HSP90AA1、PTGS2、MTOR。这些基因可能是在治疗缺血性脑卒中过程中，三七总皂苷和外泌体miR-21发挥重要作用的节点，为治疗缺血性脑卒中的关键靶点。

A：PPI网络；B：核心基因。

2.4 化合物-靶点-通路网络构建 “活性化合物-靶点-疾病-通路”网络结果如图4所示，该网络有74个节点，209条边，其中度值较大的活性成分有人参炔三醇(panaxytriol，5)、三七皂甙B1(sanchinoside B1，4)、三七皂甙R3(notoginsenoside R3，4)、三七皂甙R1(notoginsenoside R1，4)、人参皂苷Rb1(ginsenoside Rb1，4)，这可能是三七总皂苷治疗缺血性脑卒中的主要活性成分。而度值较大的靶点有STAT3(9)、VEGFA(8)、HSP90AA1(8)、BCL2L1(7)、MAPK1(5)、EGFR(5)、PIK3CD(4)、IGF1R(4)，这些可能是三七总皂苷活性成分与外泌体miR-21共同干预缺血性脑卒中的主要靶点 。

图4 缺血性脑卒中靶点-三七总皂苷-miR-21靶点网络图

2.5 主要活性成分-关键靶点分子对接 对三七总皂苷主要活性化合物人参炔三醇(panaxytriol)、三七皂甙B1(sanchinoside B1)、三七皂甙B1(notoginsenoside B1)、三七皂甙R3(notoginsenoside R3)及对应的靶点STAT3、VEGFA、HSP90AA1、BCL2L1、MAPK1进行分子对接。通常认为，对于蛋白质-配体复合物，结合能越低，结合亲和力越高。以结合能≤-5.0 kJ/mol为标准，结果表明，所有选定的生物活性成分与受体的最小结合能远低于-5.0 kJ/mol。表2显示了与每个核心靶点对接的对应种活性成分中结合能最低的具体信息。图5为对接结果的可视化。分子对接结果表明，重要的生物活性成分与核心靶点具有良好的结合力。

A：Notoginsenoside R2与STAT3对接；B：Sanchinoside B1与STAT3对接；C：Notoginsenoside R2与VEGFA对接；D：Sanchinoside B1与HSP90AA1对接；E：Panaxytriol与HSP90AA1对接；F：BCL2L1与Sanchinoside B1对接；G：Sanchinoside B1与MAPK1对接；H：Panaxytriol与MAPK1对接

表2 分子对接结合能

3 讨论

缺血性脑卒中大多数由血栓形成和栓塞引起[13-14]，动脉闭塞缺血后，每分钟有超过200万个神经元凋亡[15]。治疗缺血性脑卒中的首要目标是尽快解除动脉梗阻，恢复血流，实现再灌注，以减少脑组织损伤。然而，恢复血流会加重脑损伤和功能损伤，导致脑缺血再灌注损伤，损伤的机制复杂，涉及多靶点、多种信号通路和生物学过程[16-17]。静脉溶栓已被广泛用于治疗缺血性脑卒中，但存在一定局限性如导致出血或有时间窗限制[18-19]。因此，有必要寻找新的治疗缺血性卒中的药物。

中草药是发现新药的重要资源，诸多从中草药中提取的天然产物对缺血性脑卒中有确切疗效[20]。三七总皂苷是从传统中药三七中提取的主要成分，主要有效成分为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd和人参皂苷Re等，已经广泛应用于缺血性脑卒中的治疗[21]。在本研究中，通过中药数据库查询到三七总皂苷的12个活性成分在缺血再灌注中具备保护神经的作用，如三七皂苷R1通过抑制内质网应激途径来保护大脑免受缺氧缺血性损伤[21]，人参皂苷Rb1可以通过抑制NF-κB转录活性和促炎细胞因子的表达来减轻脑缺血性损伤[22]，人参三醇能抑制促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表达，从而抑制小胶质细胞诱导的神经元死亡[23]。

外泌体携带蛋白质、核酸、脂质等多种小分子物质，这些分子可以选择性地被其他细胞识别或转移到其他细胞，从而影响受体细胞的表型和功能[24]。研究表明，多种外泌体携带的miRNA在缺血性脑卒中生理病理过程中发挥重要作用，同时，miR-21是值得关注的分子之一[25-28]。体外研究证实miR-21-5p的高表达，可以抑制配对免疫球蛋白受体(BPirB)以减轻脑缺血损伤。此外，miR-21的水平上调后，通过抑制TLR4/NF-κB通路，从而抑制神经元凋亡和ROS的产生，提高增殖活性，发挥神经保护作用[29]。

本研究通过网络药理学和数据挖掘预测得到47个共同作用靶基因，通过构建PPI网络，CASP3、EGFR、VEGFA、STAT3、HIF1A、ESR1、BCL2L1、HSP90AA1、PTGS2、MTOR被确定为排名前10的核心靶点。细胞凋亡是I/R的必然生理过程，CASP3在细胞凋亡的执行阶段起核心作用，其编码的蛋白质是一种半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶[30]，抑制CASP3的表达可以减少神经元凋亡，并能改善缺血再灌注损伤后的空间和记忆障碍[31-32]。最近研究表明，血清CASP3水平与恶性大脑中动脉梗死(MMCAI)患者的死亡率正相关[33]。STAT3是 JAK2/STAT3 通路的重要环节，降低STAT3的磷酸化能抑制下游促炎细胞因子，减轻缺血性脑卒中损伤[34]。CHEN S等[35]研究发现，STAT3在小胶质细胞活化和神经炎症中起关键作用，抑制STAT3可能缓解缺血性脑卒中的进展。缺血性脑卒中后，STAT3激活促进自噬，在XIA Y G等[36]的研究中，使用人诱导多能干细胞(iPSC，iMSC-sEV)抑制STAT3能抑制自噬并促进血管生成。BCL2L1属于抗凋亡蛋白家族的一员，其表达量增加能减少神经元的凋亡，在动物模型上，BCL2L1能有效抑制Caspase-9等凋亡相关蛋白的表达的活化起到神经保护作用[37]。VEGFA能诱导血管内皮细胞的增殖和迁移，是生理和病理条件下血管生成的主要调节剂，有报道指出，急性缺血性脑卒中患者VEGFA低表达[38]，VEGFA高表达能促进卒中后血管生成并改善长期神经功能恢复[39]，因此，VEGFA是潜在的缺血性脑卒中诊断标志物和干预靶点。HIF1A是机体对缺氧的适应性反应的主要转录调节因子，通过上调HIF1A的表达，能介导 VEGF 的转录活性，进而促进I/R脑组织和脑微血管内皮细胞的管腔生成和细胞增殖[40]。LIU B W等[41]研究发现，激活HIF1A能改善脑卒中后的神经功能、存活率和梗死体积。这些结果表明，靶基因在缺血性脑卒中中与抗凋亡、促进血管再生、调节缺氧耐受有关。

GO富集分析表明，共同调控核心基因在细胞的多个组分中对生物学过程有凋亡过程的负调控、一氧化氮生物合成过程的正调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控中发挥作用。在KEGG通路的富集中，蛋白多糖与癌症通路是值得关注的通路之一，蛋白聚糖是存在于细胞膜和细胞外基质中的复杂分子，在细胞黏附、迁移、增殖和信号通路中起着重要的作用。已有研究表明，缺血性脑卒中后，富含蛋白多糖的神经胶质瘢痕，会阻碍轴突再生并限制神经的再生能力，进而干扰功能恢复[42]。然而，目前尚不清楚三七总皂苷是否在缺血性脑卒中发病进程中具备调节蛋白聚糖作用。因此，应进行进一步研究以证实这一点。

综上所述，本研究结果表明，三七总皂苷的多个活性化合物与外泌体miR-21共同调控靶基因，进而多途径、多通路干预缺血性脑卒中进程，这些发现为后续的临床和实验研究指明了方向和科学依据。但本研究仍存在一定局限性，如网络药理学的数据库迭代更新和不同数据库算法差异，导致预测结果不同。未来仍需通过实验验证相应通路和靶点，以确认本研究预测结果的准确性。