牦牛角药用功效及物质基础研究进展与资源化利用展望△

赵晶晶，刘睿，武文星，朱昭颖，宿树兰，晋玲，昂青才旦，段金廒*

1.南京中医药大学 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心/国家中医药管理局中药资源循环利用研究重点实验室/江苏省方剂高技术研究重点实验室，江苏 南京 210023；

2.甘肃中医药大学 教育部中藏药省部共建协同创新中心，甘肃 兰州 730000；

3.青海藏医院，青海 西宁 810007

牦牛角是牛科动物牦牛Bos grunrtiensL.（藏族语称yak）的犄角，是传统藏族医药学中的一种特有药材[1]。牦牛角呈圆锥形，角先向上，再向外，近末端复向内向上，角尖略向后弯；表面呈棕黑色或灰黑色，全角中上部富有光泽，中下部则有纵裂纹及坚硬刺手的疏毛，靠近基部有粗糙状环纹，习称“角轮”；基部略扁，锯口面类圆形，内有坚硬质重的角柱，习称“骨塞”，骨塞长度约占全角的2/3，表面有突起的纵棱，与其外部角鞘通过软组织紧密嵌合，内部光滑致密有珍珠光泽；质坚硬，气微腥，味酸、咸[2]。

本文综述了牦牛角的化学成分组成、生物活性评价、药用价值体现、资源化利用等方面的研究进展，并就加强牦牛角的医药领域的基础性研究、研究与制定牦牛角药材标准、重视牦牛角药用价值的深度挖掘等方面提出了若干建议，以期为牦牛角这一宝贵民族动物药资源的多元化、高值化利用提供参考。

1 牦牛角功效物质基础

1.1 蛋白质及含巯基多肽类

牦牛角入药部分为外层角鞘，主要成分为角蛋白等蛋白质及多肽类物质。基于同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ），从角类动物药（犀角、广角、羚羊角、水牛角、牦牛角、藏羚羊角、山羊角）中鉴定出591个蛋白质，主要为Ⅰ型角蛋白（KRT）、Ⅱ型KRT 等与连接蛋白（junction plakoglobin、plakophilin、desmoglein 等）[3-4]。基于蛋白质类成分定量分析，结合多元统计方法对蛋白质类型、蛋白质相对含量归类比较，结果表明牦牛角与犀角的蛋白质类成分组成接近。采用二维电泳（2-DE）联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDITOF-MS）对牦牛角中的蛋白质成分进行分析，鉴定出5个与活性相关的蛋白质成分[5]。

KRT是一种由长而中空的纤维小管组成的复合构造，通过硫交联（-S-S-）来完成纤维与基体中间的连接[6]。然而，这些含-S-S-键的蛋白质在特定条件下降解及-S-S-键断裂，可形成含有巯基（-SH）的多肽、寡肽类物质。采用荧光衍生法测定巯基含量，间接表征角类动物药中含巯基的多肽、寡肽类含量，结果显示白牦牛角、黑牦牛角、花牦牛角水提液中的巯基浓度分别为56.5、66.0、69.0 mol·L-1，三者差异较小[7]。

1.2 氨基酸类

采用薄层色谱法及氨基酸分析仪分别对牦牛角中的水解氨基酸进行分析，结果表明牦牛角中含有19 种水解氨基酸，分别为谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、亮氨酸、苏氨酸、酪氨酸、脯氨酸、甘氨酸、赖氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、色氨酸。牦牛角所含的人体必需7 种氨基酸中，亮氨酸质量分数最高（4.27%～8.58%），其次分别为苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸。牦牛角中婴幼儿必需的精氨酸质量分数较高，为6.81%～11.28%[8]。以邻苯二甲醛柱前衍生法测定白、花、黑3 色牦牛角中牛磺酸质量分数，分别为24.3、32.8、36.4 μg·g-1。对羚羊角、藏羚羊角、犀角、广角、牦牛角、水牛角中水解氨基酸及必需氨基酸进行聚类分析及相似性评价，结果表明牦牛角在氨基酸组成方面与犀（广）角最接近[9]。索有瑞等[10]对青海不同地区牦牛角中17 种氨基酸的含量进行分析，结果表明玉树州牦牛角中氨基酸总量最高，其次为海北州、海南州、黄南州。

1.3 核苷类

采用亲水作用色谱-超高效液相色谱-三重四联串联质谱法（HILIC-UPLC-QQQ-MS/MS）对羚羊角、藏羚羊角、犀角、广角、牦牛角、水牛角等角类动物药中14 种核苷和碱基进行定性和定量分析，结果表明牦牛角中含胸腺嘧啶、腺嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、鸟嘌呤、鸟苷、2′-脱氧鸟苷、肌苷、2′-脱氧肌苷、腺苷、胸苷、尿苷、胞苷13 种核苷及碱基成分，总质量分数为218.02～248.80 µg·g-1。以层次聚类分析和主成分分析对核苷类成分测定结果进行归类分析，结果表明牦牛角的核苷与碱基含量组成上与犀角相近[11]。

1.4 宏微量元素类

采用原子吸收分光光度法及原子荧光光度法分析白、花、黑3 色牦牛角中的铅、镉、银、汞、硒、锡、砷、硫、硅、磷、钡、锂、镍、锶、钙、钾、镁、钠、铝、铬、铜、铁、锰、锌24 种元素，采用统计方法对其进行聚类分析，结果表明花、白、黑3 种牦牛角，水牛角与犀（广）角间的相似度趋近。花、白、黑3种牦牛角之间无明显差异[9]。

对青海不同地区（海北州、海南州、玉树州、黄南州）牦牛角中的16种宏微量元素进行分析（表1），结果表明这些元素在牦牛角中长期蓄积的分布量随地区不同存在较大的差异[12]。有研究者分别采用不同数学模型计算分析青海高原不同地区牦牛角中微量元素综合得分，对产地质量进行综合评价，结果显示海南州共和县所产牦牛角质量最优，依次是玉树州、海北州、海南州贵南县、黄南州[13-16]。

表1 青海省不同地区牦牛角宏微量元素分析

1.5 其他类物质

本课题组前期建立了动物角中胆固醇的高效液相色谱蒸发光散射法（HPLC-ELSD），测得白、花、黑3 色牦牛角中游离胆固醇质量分数分别为3.77、3.73、3.61 mg·g-1，总固醇质量分数分别为3.890、3.964、3.627 mg·g-1；运用分光光度法对白、花、黑3 色牦牛角中的氨基己糖进行分析，质量分数分别为1.932、1.899、1.923µg·g-1；甾类HPLC 图谱相似度评价发现，3 种牦牛角、水牛角、藏羚羊角与犀（广）角的甾类成分相近，无明显差异[9]。对青海不同地区牦牛角的常规化学成分测定结果表明，牦牛角干物质中以粗蛋白为主，平均质量分数为82.7%，其次为粗脂肪、粗纤维。干物质、粗蛋白、粗脂肪、灰分等主要化学成分质量分数在海北州牦牛角中最高，其次为玉树州、黄南州、海南州[10]。

2 生物活性

2.1 解热活性

牦牛角超细粉对过期三联疫苗-NS 致发热家兔具有解热作用，口服给予1.5 g·kg-1（以生药量计）牦牛角后90 min 产生明显的解热作用，且作用维持到给药后120 min[9,17]。经热提法所得的牦牛角中牦牛肽粗提取液对酵母致发热小鼠具有解热效应[18-19]，并且呈剂量依赖性。比较分别以3、9 g·kg-1生药剂量的西藏牦牛角与水牛角替代古方犀角汤中的犀角后对发热家兔的解热作用，结果表明以牦牛角替代的犀角汤给药后60 min 表现出明显的解热作用，药效维持4 h以上，解热效应优于以水牛角替代的犀角汤[20]。采用微量热技术表征羚羊角、山羊角、水牛角、牦牛角仿生提取液作用于模式生物（大肠埃希氏菌）时的生物反应差异，以建立相应的生物反应指纹来评价动物角样本的生物热特性，结果表明羚羊角、山羊角、水牛角、牦牛角仿生提取液给药后均减少了大肠杆菌生长的总热量，提示羚羊角、山羊角、水牛角、牦牛角具有潜在的抗菌特性，与传统角类药物具有解热作用观念相一致[21]。基于活性导向对牦牛肽粗提物及牦牛角热提液进行分离，跟踪分离产物的解热镇痛活性，结果表明牦牛角热水提取液中肽类成分活性确切，这些肽类成分对热稳定，相对分子质量＜30 kDa[18-19]。

2.2 镇静、镇痛活性

采用光电法与协同戊巴比妥钠睡眠实验探究牦牛角镇静效应，结果表明灌胃给予牦牛角（1.375、2.750、5.500 g·kg-1，以生药量计）能明显减少小鼠自发性活动次数及延长小鼠睡眠时间，且镇静作用呈一定剂量依赖性[9,22]。采用热板法和醋酸扭体法探究牦牛角镇痛效应，结果表明牦牛角经热提及5%的碱提所得肽粗提物具有明显的镇痛活性[18-19]。采用醋酸扭体法探究经热提所得的牦牛角肽粗提物的镇痛效应，结果表明牦牛角肽粗提物组小鼠扭体次数远低于空白组小鼠，提示牦牛角肽粗提物具有较强的镇痛活性[19]。

2.3 凝血与活血双重活性

研究表明，经不同提取方式得到的牦牛角提取物的凝血作用呈现双重药理学活性，采用毛细管法探究牦牛角超细粉对小鼠凝血时间的影响，口服给予5.5 g·kg-1生药牦牛角超细粉后，小鼠凝血时间较空白对照组显著缩短（P＜0.05），表明牦牛角原粉具有一定的促进凝血作用[9]。牦牛角超声提取液可显著延长家兔血浆复钙时间、凝血酶时间和凝血酶原时间，具有良好的抗凝作用[23]。观察牦牛角超声提取液对家兔体外血栓溶解率和全血凝块在12、24、48 h 溶解率以评价牦牛角的抗血栓作用，结果表明牦牛角超声提取液对家兔体外血栓溶解率与空白组差异有统计学意义（P＜0.01），全血凝块48 h溶解率可达94%，具有良好的抗血栓作用[23]。牦牛角的主要生物活性见表2。

表2 牦牛角生物活性

3 现代用药剂型

角类药物在使用方面尚存在有效成分溶出率低、患者顺应性差等劣势。为此，有团队研究了一种牦牛角新型藏药饮片炮制方法[24]，即取牦牛角粉进行水解、超声提取，得到滤液和滤渣，将滤渣进行2次提取，合并3 次滤液并调节pH，得到牦牛角提取液，加入辅料牛奶和黄酒后浓缩、干燥，得到牦牛角藏药饮片。所制得的牦牛角藏药饮片口服异味小、口感好，有效成分含量提高，炮制时间短，适合于工业生产。此外，制备牦牛角胶凝胶剂亦可改善溶出率与顺应性问题[25]，即将牦牛角进行破碎、漂洗、浸泡、砂烫，将砂烫后的牦牛角在pH 4.5～5.5 的条件下加入蛋白酶混合液酶解，然后煎煮，所获煎煮液加入明矾搅拌、静置，除沫后加入冰糖、黄酒、豆油和凝胶剂进行加热浓缩，至清胶液开始挂旗呈稠膏状，冷却至半固体后切制、摊晾，获得牦牛角胶，其L-羟脯氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸4 种氨基酸质量分数平均提高97.20%。

4 建议与展望

动物药资源是我国中医药体系的重要组成部分，在我国有悠久的应用历史，由于其临床疗效显著，为历代医药学家推崇，为民族健康与发展做出了独特贡献。近年来动物药研究与开发备受关注，其相关科学研究逐渐深入和系统[26]。

4.1 牦牛角的传统功效物质基础与生物学机制科学表征有待深入

相较于植物源药材，我国动物源药材的功效物质等基础性研究尚有较大差距，除了自身理化性质较为复杂外，其蛋白质类及杂化的糖蛋白、糖肽、糖脂等生物大分子物质的分离纯化、结构鉴定、活性表征和作用机制阐明均存在技术瓶颈，有待生命科学的进一步发展和生物化学与分子生物学的进步提供关键支撑。迄今，关于牦牛角的药用价值研究以其解热、镇静、凝血、抗血栓等活性的初步研究较多，尚缺乏系统深入的传统功效物质基础和作用机制研究。因此，需要进一步对牦牛角的蛋白质类、多（寡）肽类、特殊氨基酸类、特征小分子类等多种类型化学组（成）分进行系统分析与活性评价，并结合生物化学、分子生物学、细胞生物学及多组学技术揭示牦牛角传统功效的科学内涵，为牦牛角新资源药材的开发提供系统的科学证据。

类效物质替代是解决动物药资源供给不足的有效策略，人工牛黄、人工麝香已是成功的典范。揭示其功效物质基础与作用机制，是类效物质替代策略的关键环节，也是替代产品创制的基础和前提。围绕珍稀角类动物性药材的功效物质及其替代性研究取得了一定的进展。基于“物质基础-生物效应-体内过程”开展牦牛角、山羊角、水牛角替代羚羊角应用基础研究[27]，基于活性肽组释放与类效性评价牦牛角、山羊角替代资源[28]，基于蛋白质组的水牛角、山羊角替代羚羊角类效性研究[29]，基于“蛋白质/肽组-修饰组”研究策略建立动物药质控新模式[30]等，对珍稀动物药替代资源的发现进行了不懈的探索。

4.2 牦牛角的多元化高附加值产品开发利用亟待加强和深入

中药资源学研究内容贯穿于中药资源生产与利用全过程，通过进一步集成现代科学体系中药学、生物学、化学与分析学、工程技术、信息技术等理论与方法，服务于中药资源的合理生产与科学利用，为我国牦牛资源经济产业链的延伸、资源利用效率和经济效益的提升、资源性产品的品质提高等提供有力支撑，为充分挖掘和释放青藏高原牦牛资源产业蕴含的巨大价值潜能提供有效的支持。通过科技赋能，逐步改变长期以来依赖自然资源和依靠粗放、廉价、低效的资源耗竭式发展方式和层次结构相对较低的发展模式，不断拓展和推动这一特色药用动物资源多层次、多途径开发模式的形成，必将造福于民族区域经济，丰富我国动物药资源宝库。

中药资源是国家战略资源，是中医药事业和中药产业发展的物质基础。探索中药资源的科学保护和合理开发利用，以及新资源发现和替代性研究等诸方面的理论和技术创新，保障中药资源的可持续利用是中药及民族药物资源永恒的话题。随着以中药及天然药物资源为原料的资源产业链日益延伸，中药资源经济在国民经济和生物医药行业的地位日益凸显，国内外消费市场对绿色产品的需求不断提高。应采取积极的寻找替代和资源补偿策略，聚焦药用价值大、资源供给难的中药材品种，采用行之有效的多元化手段，切实解决保障供给问题。