新疆阿魏地上部位中的1对新的非对映异构体△

霍晓爽，王慧娟，刘慧萍，董爱军，王华翔，王钧篪，斯建勇

中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所/中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，北京 100193

新疆阿魏Ferula sinkiangensisK.M.Shen 为伞形科阿魏属植物，是仅产于我国新疆维吾尔自治区的药用植物，具有消积、化瘕、散痞、杀虫的功效，其在当地已有几个世纪的药用历史[1]。植物化学研究表明，香豆素、芳香酸内酯、倍半萜内酯及含硫化合物是新疆阿魏的主要成分[2-3]。其中倍半萜香豆素类化合物为其特征性化学成分，该类化合物主要分布于12个属中，包括阿魏属、胡萝卜属、Heptaptera属、氨胶芹属、蒿属、蓍属、菊蒿属、春黄菊属、黏周菊属、大戟属、麻风树属和木橘属[4]，特别是阿魏属被认为是天然倍半萜香豆素的主要来源，自1982 年以来，已报道的177 个天然倍半萜香豆素类化合物中就有约77%（135个）是从阿魏属植物中鉴定出来[5-6]。新疆阿魏具有多种药理活性，包括抗溃疡、抗炎和抗氧化等[7-8]，被广泛应用于胃肠道疾病、类风湿性关节炎、支气管炎等炎症相关疾病的治疗[9-10]。近年来，新疆阿魏由于其自身的生长特性，以及生长环境破坏严重、采收不当等因素而日益濒危[11]。新疆阿魏常用的药用部位为树脂，只能通过切割根茎产生，且极难获得，而易获取的地上部位则常被丢弃，造成了极大的资源浪费。因此，若能将新疆阿魏地上部位变废为宝，从中发现新的天然活性成分，将对新疆阿魏的资源利用起到极为重要的作用。本研究对新疆阿魏地上部位95%乙醇提取物的二氯甲烷部位进行化学成分研究，分离得到了1 对新的非对映异构体(4′R,5′S,6′R,9′R)-新疆阿魏醇A（1）和(4′S,5′R,6′R,9′R)-新疆阿魏醇A（2）；依据紫外（UV）光谱、红外（IR）光谱、高分辨-电喷雾离子源-质谱（HR-ESI-MS）、核磁共振（NMR）波谱等数据确定了其平面结构和相对构型（图1），进一步通过电子圆二色谱（ECD）和Mosher 法确定了其绝对构型；采用脂多糖（LPS）诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 炎症模型评价其体外抗炎活性。

图1 化合物1和2的结构

1 材料

1.1 细胞

RAW264.7 细胞购自中国医学科学院基础医学研究所。

1.2 试药

药材于2020 年5 月采于新疆伊犁，经新疆中药民族药研究所李晓谨研究员鉴定为新疆阿魏Ferula sinkiangensisK.M.Shen 的地上部位，标本存放于新疆中药民族药研究院（标本号：XJAWDS-202005-S）。

高糖DMEM 培养基、胎牛血清（FBS）、青-链霉素混合物均购于Gibco 公司；磷酸盐缓冲液（PBS，Hyclone 公司）；地塞米松（DEX）、LPS 均购于Sigma 公司；四甲基偶氮唑盐（MTT，北京索莱宝科技有限公司）；二甲基亚砜（DMSO，Ameresco 公司）；一氧化氮（NO）检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Mosher 试剂（百灵威科技有限公司）；色谱级甲醇（Fisher 公司）；其他试剂均为分析纯（北京化工厂）；柱色谱硅胶（300～400、100～200目，青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20凝胶（Pharmacia Biotech公司）。

1.3 仪器

LTQ-Orbitrap XL 型质谱仪、UV-2550 型光谱仪（Shimadzu 公司）；AV600 型核磁共振波谱仪（Bruker 公司）；LC3000 型高效液相色谱仪（北京创新通恒科技有限公司）；FTIR-8400S 型光谱仪（Shimadzu 公司）；341 型旋光仪（Perkin-Elmer 公司）；J-815 型圆二色谱仪（Jasco 公司）；ODS-A型色谱柱（250 mm×10 mm，50 μm，YMC 公司）；MQX200型酶标仪（Bio Tek公司）。

2 方法

2.1 提取与分离

取新疆阿魏地上部位约8.5 kg，用95%乙醇（120 L）回流提取2 次，每次2 h。合并提取液并滤过，经减压浓缩干燥得浸膏约2700 g。浸膏用甲醇复溶吸附于等量的硅藻土上并完全干燥后，置于索氏提取器中依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇回流提取（每次更换溶剂时，保证前1 个极性小的溶剂充分提取），提取液减压浓缩至稠膏状，得到石油醚部位（200 g）、二氯甲烷部位（130 g）、乙酸乙酯部位（29 g）和甲醇部位（2100 g）。

二氯甲烷部位经正相硅胶柱色谱（100～200目）分离，二氯甲烷-甲醇（0∶1→0∶1）梯度洗脱得到3个组分B-1、B-2和B-3。B-3组分进一步经正相硅胶柱色谱（300～400目），石油醚-乙酸乙酯（5∶1→0∶1）梯度洗脱，得到10 个组分（Fr.3a～3j），其中Fr.3g经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱纯化后，再由半制备液相色谱进一步分离纯化，在75 min 内经甲醇-水（62∶38→44∶56）梯度洗脱，得到化合物1（tR=63.2 min，11 mg）和2（tR=70.5 min，12 mg）。

2.2 细胞培养

使用含10% FBS 的DMEM 培养基，于温度37 ℃、相对湿度100%、5% CO2的培养箱内培养细胞，选择对数生长期的细胞进行各项实验。

2.3 样品溶液的配制

将化合物1 和2 分别用DMSO 溶解，配制成浓度为500 mmol·L-1的储备液，分装保存于-20 ℃，使用前用培养基稀释成所需浓度，并且保证DMSO的最终质量分数＜0.02%。

2.4 MTT 法检测化合物对RAW264.7细胞增殖活性的影响

通过MTT 法[12]检测了受试样品对细胞存活率的影响。将处于对数生长期的RAW264.7细胞以1×104个/孔的密度接种于96 孔板中，分别加入终浓度为6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol·L-1的受试样品，对照组不加样品。在37 ℃、5% CO2的培养箱内孵育24 h，随后每孔加入MTT（5 mg·mL-1）20 μL，继续孵育4 h。弃去上清液，每孔加入DMSO 150 μL 溶解细胞内的甲臜晶体。随后用酶标仪避光低速震荡5 min，在570 nm 波长处检测每孔的吸光度（A），按照公式（1）计算细胞存活率。

2.5 Griess 法检测化合物对RAW264.7 细胞NO 释放量的影响

取对数生长期的RAW264.7细胞，以2×105个/孔的密度接种于96 孔板，分别加入终浓度为6.25、12.50、25.00、50.00 μmol·L-1的受试样品和终质量浓度为1 μg·mL-1的LPS刺激24 h。同时，设置对照组（不加样品，不加LPS）、模型组（不加样品，仅加入LPS）和阳性对照组（加LPS 和终浓度为10 μmol·L-1的DEX），在37 ℃、5% CO2的培养箱内共同孵育24 h。孵育结束后，每孔取细胞上清液50 µL 分别转移到新的96 孔板中，室温下加入等体积的Griess试剂[13]。15 min后，使用酶标仪在540 nm波长处检测各孔A，并通过标准曲线计算细胞上清液中NO的含量。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 结构解析

化合物1：无色油状物，UV（甲醇）λmax（log ε）：323（3.78）nm；[α]20 D：+12.0（c0.1，甲醇）；HR-ESI-MS（正离子模式）给出其准分子离子峰m/z:421.198 2[M+Na]+（C24H30O5Na，相对分子质量理论值为421.199 1），推断其分子式为C24H30O5，不饱和度为10。UV 光谱中在323 nm 处出现香豆素母核的特征吸收峰。1H-NMR（表1）中显示除香豆素母核δ7.63(1H,d,J=9.5 Hz,H-4),7.39(1H,d,J=8.6 Hz,H-5),6.88 (1H,dd,J=8.6,2.4 Hz,H-6),6.84 (1H,d,J=2.4 Hz,H-8),6.28 (1H,d,J=9.5 Hz,H-3) 外，还有2 个烯氢信号δ5.23 (1H,s,H-12′b),5.08 (1H,s,H-12′a)，3 个甲基信号δ0.93 (3H,d,J=6.8 Hz,Me-13′),0.92 (3H,d,J=6.8 Hz,Me-15′),0.62 (3H,s,Me-14′)；13C-NMR（表1）显示共有24 个碳，除去香豆素母核的9 个碳信号（δ161.7,161.2,155.9,143.9,129.1,113.7,113.1,113.1,101.8）外，还剩15 个碳，包括1 个羰基δ213.8、1 个双键δ147.6,112.4（结合其氢谱的峰型及在碳谱上的化学位移，推断其为末端双键）、1个连氧次甲基δ73.6、1个连氧亚甲基δ72.1。除去香豆素母核的7 个不饱和度、1 个羰基和1 个双键的2 个不饱和度，仍剩下1 个不饱和度，因此推测化合物1 可能为单环倍半萜香豆素结构。

表1 化合物1和2的1H-NMR（600 MHz，CDCl3）和13C-NMR（150 MHz，CDCl3）数据

通过2D NMR 图谱对化合物1 的平面结构进行进一步确证。1H-1H COSY谱中显示自旋体系（H-2′/H-1′/H-10′、H-4′/H-13′、H-9′/H-11′、H-7′/H-6′/H-15′）的存在，结合HSQC 谱，共得到4 个结构片段（C-2′-C-1′-C-10′、C-4′-C-13′、C-7′-C-6′-C-15′、C-9′-C-11′，图2）。在HMBC谱中，H-11′仅与C-8′、C-9′有远程相关信号，说明该化合物的B 环为开环结构；从H-12′与C-7′、C-8′、C-9′的远程相关信号确定了末端双键的位置在8′位；此外，从H-13′与C-3′、C-4′、C-5′，H-14′与C-4′、C-5′、C-6′、C-10′，H-15′与C-5′、C-6′、C-7′的远程相关信号确定了3 个甲基及羰基的连接位置，再结合HSQC 谱得到的4个结构片段，至此化合物1的平面结构基本可以确定。而从H-11′与C-7的远程相关信号最终确定了倍半萜片段与香豆素的连接位置。

化合物1 倍半萜六元环部分的相对构型可通过NOESY 谱确定，在NOESY 图谱中可观察到H-4′/H-14′有远程相关信号，说明其位于环的同侧（图2），进而可确定C-4′、C-5′位的绝对构型为4′R,5′S或4′S,5′R。但由于C-6′、C-9′位于链状结构上，不能直接通过NOESY图谱确定其构型，需通过进一步的实验确定。

图2 化合物1和2中主要的1H-1H COSY、HMBC和NOESY相关信号

化合物1 的绝对构型通过Mosher 法[14]并结合计算ECD 和实验ECD 图谱的拟合[15]来确定。首先，化合物1 中C-9′位连有1 个仲醇，其绝对构型可通过Mosher 反应[16]来确定。在Mosher 实验中，化合物1与(R)-(-)-α-甲氧基苯乙酸（MPA）和(S)-(+)-α-甲氧基苯乙酸在一定条件下发生酯化反应，生成相应的衍生物1-(R)-MTPA（1a）和1-(S)-MTPA（1b）。基于该反应符合MTPA应用规则[17]，从图3中可以看出化合物1 所形成的非对映异构体1a 和1b 之间的1H-NMR 化学位移变化（ΔδSR）有明显差异，因此可确定C-9′位的绝对构型为R构型。

图3 化合物1的S-、R-MTPA-Mosher酯的构象及由此得到的Δδ值（Hz）在化合物1“前”和“后”两侧的分布

基于以上结果，化合物1可能存在4种绝对构型（4′R,5′S,6′R,9′R、4′R,5′S,6′S,9′R、4′S,5′R,6′R,9′R、4′S,5′R,6′S,9′R），最终通过计算ECD 和实验ECD 图谱拟合匹配的方法进行确定。首先进行蒙特卡罗构象搜索，并选择波尔兹曼分布＞5%的构象，在B3LYP/6-31+g (d) 水平上，以甲醇为溶剂采用密度泛函理论（DFT）进行构象优化，然后在B3LYP/6-311+g (d,p)水平上，以甲醇为溶剂采用含时密度泛函理论（TD-DFT）进行能量计算，计算了60个激发态的转子强度。最后使用SpecDis 1.7和GraphPad Prism 8，设定sigma 值为0.2 eV，拟合生成计算ECD 图谱。最终的计算ECD 图谱结果显示4′R,5′S,6′R,9′R构型的计算ECD 图谱与实验ECD 图谱趋势较为吻合（图4），故确定化合物1 的绝对构型为4′R,5′S,6′R,9′R（图1），并将其命名为(4′R,5′S,6′R,9′R)-ferusingenol A，给出通俗名称为(4′R,5′S,6′R,9′R)-新疆阿魏醇A。

图4 化合物1和2的实验ECD和计算ECD图谱

化合物2：无色油状物，UV（甲醇）λmax（log ε）：323（3.47）nm；[α]20 D：-5.0°（c0.1，甲醇）；HR-ESI-MS（正离子模式）给出其准分子离子峰m/z：421.197 9[M+Na]+（C24H30O5Na，相对分子质量理论值为421.199 1），与化合物1 相对分子质量相同。其1H-和13C-NMR 特征与化合物1也基本一致，以上结果说明化合物2 可能为化合物1 的非对映异构体。NOSEY 图谱显示H-4′/H-14′有远程相关信号，说明它们同样位于环的同侧，因此C-4′、C-5′位的绝对构型可能为4′R,5′S或4′S,5′R，与化合物1 一致；同样用Mosher 反应可确定其C-9′位的绝对构型为R构型。最后C-4′、C-5′和C-6′位的绝对构型通过计算ECD和实验ECD图谱的拟合匹配来确定，结果显示，4′S,5′R,6′R,9′R构型的计算ECD 图谱与实验ECD 图谱趋势较为吻合（图4），因此可确定化合物2 为化合物1 的非对映异构体，并将其命名为(4′S,5′R,6′R,9′R)-ferusingenol A，给出通俗名称为(4′S,5′R,6′R,9′R)-新疆阿魏醇A。

3.2 体外抗炎活性筛选

3.2.1化合物对RAW264.7细胞增殖的影响 如图5所示，经MTT 法检测发现，浓度在50.00 μmol·L-1以下时，化合物1 和2 对RAW264.7 细胞增殖影响较小。

图5 化合物1和2对RAW264.7细胞存活率的影响（,n=3）

3.2.2化合物对RAW264.7细胞NO生成的影响 如图6所示，与对照组比较，模型组NO 生成量显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，化合物1 和2 在浓度为50 μmol·L-1时，作用于RAW264.7 细胞24 h 后，NO 生成量均明显降低（P＜0.01）；尤其是化合物1在浓度为50.00 μmol·L-1时与DEX（10.00 μmol·L-1）效果相当。

图6 化合物1和2对LPS诱导的RAW 264.7细胞NO产生的影响（, n=3）

4 讨论

本研究从新疆阿魏地上部位95%乙醇水提取物的二氯甲烷部位中分离得到1 对新的非对映异构体，并对其体外抗炎活性进行筛选，结果发现其对LPS刺激的RAW264.7 细胞具有不同程度的抗炎活性，这不仅丰富了阿魏属的化学成分，尤其是倍半萜香豆素类化合物，还为其抗炎活性的研究提供了参考，在一定程度上对新疆阿魏资源的充分利用起到了积极的作用。