鹿角藤茎叶化学成分研究

时间：2024-07-28

吴敏，鲁建美，孙朋，贾慧珍，宋兴震，许又凯*

1.中国科学院大学生命科学学院，北京 100049；

2.中国科学院西双版纳热带植物园，云南勐仑 666303

鹿角藤属（ChonemorphaG.Don）是夹竹桃科花皮胶藤族的多年生粗壮藤本，全世界约20 种，分布于亚洲热带和亚热带地区；我国有8 种，主要分布于西南和华南各省区。鹿角藤C.eriostylisPitard为粗壮木质大藤本，主要产于云南、广西和广东，生于疏林山地及湿润山谷中[1]。鹿角藤植株皮层、叶及果均含胶乳，可制一般日常橡胶制品；其花大色艳，也是一种重要的园林景观植物[2]；老茎供药用，具有通经活络、活血止痛、接骨生肌、降压等功效，主治肾亏腰痛、高血压、风湿性腰腿痛、跌打损伤，在广西民间有治妇女黄疸的用途。

文献调研发现，鹿角藤属植物中的主要化学成分为甾体[3]、甾体糖苷[4]、甾体生物碱[5]、木脂素[6]、酚酸等。现代药理研究表明，鹿角藤的乙醇粗提物具有抗菌[7]、抗氧化和降血糖[8]等生物活性。本研究对鹿角藤95%乙醇提取物进行分离与鉴定，从中得到7个化合物，鉴定为1个木脂素类化合物（+）-丁香脂素（1），2 个香豆素类化合物异东莨菪内酯（2）、东莨菪内酯（3），1 个甾体类化合物雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（4），3个甾体生物碱类化合物丝胶树碱C（5）、清香桂碱D（6）、鹿角藤碱（7）。各化合物结构式见图1，其中，化合物2、4～6 为首次在该属植物中分离得到。

图1 鹿角藤中分离得到的化合物1～7的结构式

1 材料

1.1 试药

样品采自中国科学院西双版纳热带植物园，由西双版纳热带植物园肖春芬高级工程师鉴定为鹿角藤Chonemorpha eriostylisPitard的地上部分，标本存于中国科学院西双版纳热带植物园标本馆（标本号：HITBC-0022506）。

维生素C（VC，分析纯，批号：A15613，天津市祥瑞鑫化工科技有限公司）；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）试剂（美国Sigma 公司）；薄层色谱（TLC）和柱色谱所用试剂石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、无水乙醇、丙酮等均为分析纯（天津市大茂化学试剂公司）；柱色谱硅胶（200～300 目，青岛海洋化工厂）；TLC 板（青岛海洋化工厂）；反相硅胶RP-18（美国Merck公司）；中压色谱分离凝胶（MCI，粒径75～150 μm，日本三菱化学株式会社）；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶（粒径40～70 μm，瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司）。

1.2 仪器

DRX-500、600型核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）；QSTAR Pulsari 型串联四极杆飞行时间质谱仪（美国API 公司）；1260 型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；ODS-A 型色谱柱（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司）；Multiskan FC型酶标仪（美国Thermo Fisher公司）。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

干燥的鹿角藤茎叶地上部分7 kg，粉碎后用95%乙醇（30 L×3 次）冷浸提取，每次3 d。提取液滤过，减压蒸干溶剂得粗浸膏，用石油醚和乙酸乙酯分别萃取，得到粗浸膏87 g，再将其加到MCI 树脂中，用梯度甲醇溶液（30%、60%、90%）洗脱，将90%甲醇洗脱组分蒸干，得45 g 残留物，用硅胶拌样，再经硅胶柱色谱进行分离，用二氯甲烷-甲醇（1∶0→0∶1）梯度洗脱，经TLC 检测后将类似组分进行合并，共得到11个组分（A～K）。

将B 组分进行硅胶色谱柱分离，凝胶色谱柱纯化，最后再经高效液相色谱法（HPLC）分离得化合物2（5 mg）和3（5 mg）；将C 组分进行硅胶色谱柱分离，再用凝胶柱色谱分离，最后用HPLC 纯化，得到化合物1（5 mg）和4（5 mg）；将F组分进行硅胶柱色谱分离，然后再用制备板制备分离，用碘化铋钾显示条带的位置，刮下相应位置，甲醇洗脱，得无色结晶化合物5（15 mg）；将D 组分重新用MCI柱分离，30%甲醇洗脱，再用硅胶柱色谱分离、凝胶柱色谱纯化，得化合物6（10 mg）和7（10 mg）。

2.2 结构鉴定

化合物1：白色无定形粉末，电喷雾离子源（ESI）-质谱法（MS）给出准分子离子峰m/z419[M+H]+，相当于分子组成为C22H26O8；核磁共振氢谱（1H-NMR）(600 MHz,CD3OD)δ: 6.65 (4H,s,H-2′,6′,2″,6″),4.71(2H,d,J=4.2 Hz,H-4′,4″-OH),4.26 (2H,dd,J=9.0,6.8 Hz,H-4a,8a),3.87 (2H,dd,J=9.1,3.4 Hz,H-4b,8b),3.84(12H,s,3′,5′,3″,5″-OCH3),3.15(2H,t,J=5.5 Hz,H-1,5)；核磁共振碳谱（13C-NMR）(150 MHz,CD3OD)δ: 149.5 (s,C-3′,5′,3″,5″),136.7(s,C-4′,4″),132.7 (s,C-1′,1″),104.6 (d,C-2′,6′,2″,6″),87.7 (d,C-2,6),72.8 (t,C-4,8),56.8 (q,C-3′,5′,3″,5″-OCH3),55.5(d,C-1,5)。以上数据与文献报道一致[9]，鉴定化合物1为(+)-丁香脂素。

化合物2：橙黄色结晶（甲醇），ESI-MS给出准分子离子峰m/z193 [M+H]+，相当于分子组成为C10H8O4；1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ: 7.81 (1H,d,J=9.4 Hz,H-4),6.96 (1H,s,H-8),6.96 (1H,s,H-5),6.24 (1H,d,J=9.4 Hz,H-3),3.95 (3H,s,7-OCH3)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ: 164.1 (s,C-2),153.7(s,C-6),150.2 (s,C-8a),145.9 (s,C-7),145.9 (d,C-4),113.5 (s,C-4a),113.4 (d,C-3),112.9 (d,C-8),100.5(d,C-7),56.8(q,7-OCH3)。以上数据与文献报道一致[10]，鉴定化合物2为异东莨菪内酯。

化合物3：橙黄色结晶（甲醇），ESI-MS给出准分子离子峰m/z193 [M+H]+，相当于分子组成为C10H8O4；1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ: 7.82 (1H,d,J=9.3 Hz,H-4),7.00 (1H,s,H-8),6.66 (1H,s,H-5),6.08 (1H,d,J=9.3 Hz,H-3),3.87 (3H,s,6-OCH3)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ: 164.9 (s,C-2),152.5(s,C-7),148.8 (s,C-6),146.5 (d,C-4),110.8 (s,C-4a),109.9 (s,C-3),109.1 (s,C-5),104.3 (d,C-8),56.5 (q,6-OCH3)。以上数据与文献报道一致[11]，鉴定化合物3为东莨菪内酯。

化合物4：白色无定形粉末，ESI-MS 给出准分子离子峰m/z285 [M+H]+，相当于分子组成为C19H24O2；1H-NMR (600 MHz,CD3OD)δ: 7.30 (1H,d,J=10.1 Hz,H-1),6.22 (1H,dd,J=10.1,1.9 Hz,H-2),6.09 (1H,t,J=1.5 Hz,H-4),2.63 (1H,tdd,J=13.5,5.2,1.3 Hz,H-6),2.08(1H,dd,J=19.3,9.2 Hz,H-7),1.67 (1H,tt,J=12.5,9.1 Hz,H-7) 1.32 (3H,s,18-CH3),0.97 (3H,s,19-CH3)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 222.9 (s,C-17),188.6 (s,C-3),173.1 (s,C-5),159.2 (d,C-1),127.7 (d,C-2),124.2 (d,C-4),54.1 (d,C-9),51.6 (d,C-14),45.3 (s,C-10),36.5 (t,C-16),36.2 (d,C-8),33.7 (t,C-6),33.7 (t,C-12),32.5 (t,C-7),23.3 (t,C-11),22.8 (t,C-15),19.1 (q,C-19),14.2 (q,C-18)。以上数据与文献报道一致[12]，鉴定化合物4为雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮。

化合物5：无色针状结晶（甲醇），ESI-MS给出准分子离子峰m/z346 [M+H]+，相当于分子组成为C23H39NO；1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ: 2.37 (1H,t,J=14.4 Hz,H-2),2.22(1H,ddt,J=15.4,4.7,2.2 Hz,H-3),2.16 [6H,s,-N(CH3)2],2.06 (1H,ddt,J=8.2,3.9,2.0 Hz,H-8),2.01(1H,ddd,J=15.0,3.8,2.4 Hz,H-17),1.74 (1H,dq,J=12.9,3.5 Hz,H-20),1.06 (3H,s,19-CH3),0.94 (3H,d,J=6.5 Hz,21-CH3),0.72 (3H,s,18-CH3)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ: 214.8 (s,C-3),62.8 (d,C-20),57.7 (d,C-5),56.0 (d,C-17),55.2(d,C-9),48.2(d,C-14),45.5(t,C-4),43.1(s,C-13),41.0 (t,C-12),40.1 (q,N-CH3),40.1 (q,N-CH3),39.8(t C-16),38.9(t,C-1),36.8(s,C-10),36.7(d,C-8),32.9 (t,C-11),30.1 (t,C-2),28.6 (t,C-15),25.1(t,C-6),22.5 (t,C-7),12.6 (q,C-18),11.7 (q,C-19),10.5 (q,C-21)。以上数据与文献报道一致[13]，鉴定化合物5为丝胶树碱C。

化合物6：无色针状结晶（甲醇），ESI-MS给出准分子离子峰m/z348 [M+H]+，相当于分子组成为C23H41NO；1H-NMR (500 MHz,CDCl3)δ: 3.59 (1H,tt,J=11.1,4.8 Hz,H-3),2.42(1H,dq,J=10.5,6.4 Hz,H-20),2.16 [6H,s,-N(CH3)2],1.91～1.83 (1H,m),0.86 (3H,d,J=6.4 Hz,CH3-21),0.80 (3H,s,CH3-19),0.64 (3H,s,CH3-18)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ:71.5 (d,C-3),61.3 (d,C-20),56.8 (d,C-14),55.0 (d,C-17),54.5 (d,C-9),45.0 (d,C-5),41.9 (s,C-13),40.0 [q,-N(CH3)2],40.0 [q,-N(CH3)2],39.9 (t,C-12),38.4 (t,C-4),37.2 (t,C-1),35.6 (d,C-8),35.5 (s,C-10),32.2 (t,C-7),31.7 (t,C-2),28.9 (t,C-6),27.8 (t,C-16),24.2 (t,C-15),21.4 (t,C-11),12.5 (q,C-18),12.5(q,C-19),10.0(q,C-21)。以上数据与文献报道一致[14]，鉴定化合物6为清香桂碱D。

化合物7：砖红色无定形粉末，ESI-MS 给出准分子离子峰m/z347 [M+H]+，相当于分子组成为C23H42NO；1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ: 3.35 (1H,m,H-20),3.09 (1H,dtd,J=12.2,7.7,3.8 Hz,H-3),1.90 (1H,m,H-16),1.85 (1H,m,H-4),1.82 (1H,m,H-6),1.69(1H,d,J=10.9 Hz,H-17),1.54(1H,dd,J=10.3,6.4 Hz,H-16),1.44 (J=17.2,9.1,7.2,4.1 Hz,H-8),1.33 (3H,d,J=6.6 Hz,H-21),1.21 (1H,m,H-5),1.20 (1H,m,H-14),1.10 (1H,td,J=13.6,13.0,3.9 Hz,H-6),0.88 (3H,s,H-19),0.77 (3H,s,H-18),0.75 (1H,d,J=4.9 Hz,H-9)；13C-NMR (125 MHz,CD3OD)δ: 67.0 (d,C-20),57.2 (d,C-14),55.1 (d,C-9),53.2 (d,C-17),51.7 (d,C-3),46.0 (d,C-5),44.2(d,C-13),40.4 (t,C-12),37.7 (t,C-6),36.6 (d,C-8),36.4(s,C-10),33.9(t,C-2),32.9(t,C-11),29.4(t,C-11),27.5 (t,C-4),26.9 (t,C-16),25.2 (t,C-15),22.1(t,C-7),12.5 (q,C-18),12.4 (q,C-19),12.0 (q,C-21)。以上数据与文献报道一致[15]，鉴定化合物7 为鹿角藤碱。

2.3 DPPH自由基清除活性检测

用无水乙醇将待测样品和DPPH 粉末分别配成100 μmol·L-1的溶液，4 ℃避光保存备用。在96 孔板内分别加入DPPH 溶液100 μL 与待测样品液100 μL 混匀，在室温避光反应30 min 后，在酶标仪的517 nm 波长下测吸光度（A）。以常用抗氧化剂VC（20.00～1.25 μg·mL-1）为阳性对照[半数抑制浓度（IC50）值为2.37 μg·L-1]，以加DPPH 溶液100 μL 与无水乙醇100 μL 组为空白对照。每个样品平行测定3 次，取平均值。按公式（1）计算清除率[16]。对清除率＞50%的样品分别测试其在200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 μmol·L-1的清除率，利用SPSS 25.0 软件进行单因素方差分析和Dunnett′s多重比较检验分析数据，P＜0.05 为差异有统计学意义。采用回归分析的方法计算IC50值。

式中，A1为待测液+DPPH 的吸光度；A2为待测液+无水乙醇的吸光度；A3为DPPH 溶液+无水乙醇的吸光度。

用DPPH 自由基清除法初筛结果表明，在化合物1～7 的浓度为100.0 μmol·L-1时，其DPPH 自由基清除率分别为86.7%、21.6%、15.5%、6.0%、6.5%、8.2%、11.2%。其中化合物1 表现出较好的抗氧化活性，遂将其进行复筛，测得其IC50值为33.1 μmol·L-1。