二氢杨梅素对小鼠的抗疲劳作用及机制研究△

时间：2024-07-28

尹美玲，孙乐，滕李利，宋颜君，许利嘉，肖培根

中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所/中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室

在快速发展的社会，疲劳已成为常见的社会问题，影响人们的工作效率和生活质量[1]。疲劳是指身体极其疲惫的状态，包括精神疲劳和体力疲劳[2]。研究发现体力疲劳的产生与代谢物积累、能量紊乱、机体氧化应激损伤等相关[3]。

近些年研究发现，植物来源的天然产物，如黄酮类化合物，对改善疲劳有重要作用[4-5]。二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）是一种天然黄酮，药理活性广泛[6-8]。前期文献报道DMY具有缓解疲劳的作用，但具体的机制还有待深入研究[9-11]。结合本课题组前期研究基础，本研究采用跑轮实验和负重游泳力竭实验研究DMY 的抗疲劳作用，通过分析DMY 对小鼠生化指标、能量代谢和氧化应激通路相关基因和蛋白表达的影响，挖掘其抗疲劳的潜在作用机制，为后续深入研究提供参考。

1 材料

1.1 实验动物

无特定病原体（SPF）级ICR 雄性小鼠32 只，4 周龄，体质量18～22 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（京）2019-0010，由中国医学科学院药用植物研究所伦理委员会审批，审批号为SLXD-20210115017，饲养于12 h 明暗交替、温度（22±2）℃、相对湿度为（55±10）%环境中，小鼠自由获取食物和水，用于后续跑轮实验。

SPF 级ICR 雄性小鼠32 只，体质量为18～22 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于中国医学科学院药用植物研究所动物实验中心，实验动物生产许可证号为SCXK（京）2016-0006，由中国医学科学院药用植物研究所伦理委员会审批，审批号为SLXD-20201030014，小鼠饲养于12 h明暗交替的动物房内，饲养温度为（23±2）℃，相对湿度为45%～65%，允许小鼠自由摄食和饮水，用于后续负重游泳力竭实验。

1.2 试药

DMY（本课题组制备提取，纯度为98%）；乳酸（LD）测定试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒、尿素氮（BUN）测定试剂盒、肌酸激酶（CK）测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）测定试剂盒测定试剂盒（江苏南京建成生物工程研究所）；TranZol Up Plus RNA kit、TransScipt All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）、PerfectStart ™Green qPCR SuperMix（北京全式金生物科技有限公司）；放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液、超敏荧光化学发光试剂盒（碧云天生物技术研究所）；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂盒（北京庄盟国际生物基因科技有限公司）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔抗体、HRP标记山羊抗小鼠抗体、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（江苏康为世纪生物科技股份有限公司）；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抗体、磷酸化AMPK（pAMPK）抗体、核转录因子E2相关因子2（Nrf2）抗体（美国CST 公司）；过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）抗体（英国Abacm 公司）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，北京索莱宝生物科技有限公司）；肝激酶1（LKB1）、钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶2（CaMKK2）、腺苷酸活化蛋白激酶α2（AMPKα2）、组蛋白去乙酰化酶（SIRT1）、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子-1α（PGC-1α）、Nrf2、谷胱甘肽过氧化酶1（GPx-1）、血红素家氧酶-1（HO-1）、解偶联蛋白2（UCP2）、PPARα、GAPDH引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。

表1 实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）引物序列

1.3 仪器

YLS-10B 型小鼠转轮式疲劳仪（上海软隆科技发展有限公司）；游泳水箱（自制）；1-14k型高速低温离心机（德国Sigma 公司）；Infinite M1000 PRO型多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）；XMTD-8222型智能数显控温仪（上海精宏实验设备有限公司）；AL204 型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；G560E Vortex-Genie 2 型涡旋振荡器（美国Scientific Industries 公司）；OSE-MC8 型台式离心机[天根生化科技（北京）有限公司]；H2O3-H 型加热制冷型金属浴[卡尤迪生物科技（北京）有限公司]；SIM-F140 型制冰机（日本Sanyo 公司）；NanoPhotometer 型分光光度计（美国Implen 公司）；Fastprep-24 ™5G 型快速样品制备仪（美国MP Biomedicals 公司）；BE-6100 型微孔板迷你离心机（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；Veriti™型96孔热循环仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；CFX96 型实时定量聚合酶链式反应（PCR）仪、PowerPac Basic 型电泳仪和ChemiDoc ™ Touch Imaging System型蛋白显影仪（美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 跑轮实验

2.1.1动物分组与给药小鼠随机分为4 组，分别为对照组和DMY 低、中、高剂量组，每组8 只。对照组小鼠每日按体质量灌胃给予0.5% CMC-Na（0.01 mL·kg-1）；DMY 溶于0.5% CMC-Na 水溶液中制成混悬液，低、中、高剂量组小鼠分别灌胃20、40、80 mg·kg-1。各组小鼠每日上午给药1 次，连续给药7 d，给药期间可以自由摄水和饮食。实验结束后小鼠注射速眠新麻醉，脱颈椎处死。

2.1.2小鼠跑轮实验末次给药结束后，将小鼠放进带跑轮系统的机器中，先以16、20 r·min-1适应性训练各15 min，共30 min，再使用24 r·min-1直到小鼠力竭。记录小鼠在24 r·min-1速度下的跑步力竭距离。

2.2 负重游泳力竭实验

2.2.1动物分组与给药小鼠的分组和给药剂量设置同2.1.1项下。

2.2.2小鼠负重游泳实验末次给药后30 min，在小鼠尾根处系上相当于5%体质量的铅丝，依次放入水深约30 cm、水温为（24±2）℃的游泳箱中游泳。以小鼠头部沉入水中7 s内未浮出水面作为判断小鼠力竭的标准，记录此时间为小鼠的游泳力竭时间。

2.2.3小鼠血清及组织样本收集负重游泳实验结束后，继续灌胃给药2 d，末次给药后30 min，于2.2.2项下相同游泳装置中，各组小鼠无负重游泳15 min 后注射速眠新麻醉，摘眼球取血，静置一段时间，3500 r·min-1离心10 min（离心半径为0.6 cm），得到血清上清液，转移至-80 ℃冰箱保存。脱颈椎处死小鼠后取得腿部骨骼肌、肝脏组织，用0.9%氯化钠溶液浸洗掉血渍，滤纸吸干组织表面水分后，将组织包在锡箔纸中迅速置于液氮，随后转移至-80 ℃冰箱中冷冻保存。

2.3 血液生化指标测定

采用LD、LDH、CK、BUN 检测试剂盒，按说明书要求将血清稀释成合适质量浓度，分别检测其中LDH、CK活性及LD、BUN含量。

2.4 肌肉LD、肝糖原、肝GSH-Px测定

称取适量肌肉和肝脏组织，加入0.9%氯化钠溶液匀浆，分别采用LD、肌/肝糖原、GSH-Px 检测试剂盒检测肌肉中LD 和肝脏中糖原的含量，以及肝GSH-Px的活性，具体操作按试剂盒说明书进行。

2.5 mRNA表达量检测

分别称取小鼠骨骼肌组织和肝脏组织15～25 mg，加入TranZol 裂解液0.8 mL。按TranZol Up Plus RNA kit 试剂盒说明提取总RNA。得到的RNA 样品取少量用于总RNA的纯度和浓度检测。按TransScipt All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）试剂盒的使用说明进行反转录反应。按PerfectStart™Green qPCR SuperMix 试剂盒说明书进行qRT-PCR。以GAPDH为内参基因，mRNA相对表达量按2-ΔΔCt计算。

2.6 相关蛋白测定

称取适量小鼠骨骼肌和肝脏置于裂解液中，冰上裂解30 min 提取总蛋白，12 000 r·min-14 ℃离心20 min（离心半径为0.6 cm），得到组织上清液，采用BCA 蛋白定量试剂盒测定骨骼肌的蛋白质量浓度，然后加入1/4体积的loading buffer，95 ℃煮沸蛋白，得到实验样品。采用SDS-PAGE 分离样品，然后将样品转移到活化的聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加一抗4 ℃冰箱过夜；次日先用TBST 清洗3 次，每次10 min，然后分别加入对应的二抗室温孵育1 h，再用TBST 洗3 次，每次10 min，随后用电化学发光显影曝片，并保留相关条带，使用Image J 1.4.3 软件分析计算各蛋白灰度值。

2.7 统计学方法

所有实验数据以（ˉx±s）表示，数据符合正态分布且方差齐时采用单因素方差分析，两组之间的差异用独立的t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。采用SPSS 23.0 统计软件进行数据分析，使用GraphPad Prism 6软件制图。

3 结果

3.1 DMY对小鼠体质量及跑步力竭距离的影响

如表2 所示，在实验开始前和实验结束后，对照组及DMY各给药组小鼠组间的体质量差异无统计学意义。与初始体质量比较，实验结束时各组小鼠体质量有明显增长（P＜0.001）。在实验过程中，各组小鼠精神状态正常、皮毛光滑，没有打斗痕迹或其他异常状况。DMY 各剂量对小鼠的体质量及生长发育没有不良影响。与对照组比较，DMY 各剂量均能显著延长小鼠的跑步力竭距离（P＜0.001）。

表2 各组小鼠体质量及跑步力竭距离（, n=8）

注：与同组初始体质量比较，###P＜0.001；与对照组比较，***P＜0.001。

3.2 DMY对小鼠体质量及负重游泳时间的影响

如表3 所示，负重游泳实验进行过程中，对照组及DMY各给药组小鼠在实验开始前和实验结束后组间的体质量差异无统计学意义。与初始体质量比较，实验结束时各组小鼠体质量明显增长（P＜0.01，P＜0.001）。在实验过程中，各组小鼠无异常状况发生。与对照组比较，DMY 各剂量均能不同程度地延长小鼠的负重游泳力竭时间（P＜0.05，P＜0.001）。

表3 各组小鼠体质量及负重游泳时间（, n=8）

注：与同组初始体质量比较，##P＜0.01，###P＜0.001；与对照组比较，*P＜0.05，***P＜0.001。

3.3 DMY 对小鼠血清LD、LDH、SUN 和CK 水平的影响

结果如表4 所示，运动后，与对照组比较，DMY 各剂量可以显著降低小鼠血清中LD 水平和LDH 活性（P＜0.05）。DMY 中、高剂量组小鼠的SUN水平显著低于对照组（P＜0.05，P＜0.01）。DMY中剂量组小鼠血清中CK活性显著低于对照组小鼠（P＜0.05）。

表4 各组小鼠血清LD、SUN水平和LDH、CK活性（, n=8）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；表5～8同。

3.4 DMY对小鼠肌肉LD、肝糖原和肝GSH-Px水平的影响

结果表明，与对照组比较，DMY 各剂量组小鼠肌肉中LD 水平均降低，其中DMY 低、高剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）；肝糖原水平升高，其中DMY 中剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）；DMY 高剂量组小鼠肝GSH-Px 活性显著升高（P＜0.05），见表5。

表5 各组小鼠肌肉LD、肝糖原、肝GSH-Px水平（, n=8）

3.5 DMY 对小鼠骨骼肌AMPK 信号通路基因表达的影响

如表6 所示，与对照组比较，DMY 各剂量组小鼠骨骼肌中AMPK通路LKB1、CaMKK2、AMPKα2、SIRT1、PGC-1αmRNA表达水平升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

表6 各组小鼠骨骼肌AMPK通路蛋白mRNA相对表达量（, n=5）

3.6 DMY 对小鼠肝脏Nrf2 通路、PPARα 通路相关基因表达的影响

如表7 所示，与对照组比较，DMY 各剂量组小鼠肝脏中Nrf2、HO-1、GPx-1、PPARα、UCP2 mRNA表达水平显著升高（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

表7 各组小鼠肝脏氧化应激相关蛋白mRNA相对表达量（, n=5）

3.7 DMY 对小鼠肌肉AMPK 及肝脏Nrf2、PPARα蛋白的影响

Western blot结果显示（表8和图1），DMY 可以显著增加小鼠肌肉中pAMPK/AMPK的比值，激活了AMPK信号通路（P＜0.01）。此外，DMY也可以显著增加小鼠肝脏Nrf2、PPARα蛋白的表达（P＜0.05）。

图1 各组小鼠肌肉AMPK和肝脏Nrf2、PPARα蛋白表达

表8 各组小鼠肌肉pAMPK/AMPK和肝脏Nrf2、PPARα蛋白相对表达量（, n=3）

4 讨论

DMY 是一种黄酮类化合物，前期文献报道其具有缓解疲劳的作用，但具体的机制还有待深入研究[9-11]。运动时机体会产生疲劳，近年来研究发现疲劳的产生与体内代谢物堆积、能量损耗、氧化应激等因素有关[12-13]。疲劳最直接的体现就是运动耐力的下降[14]，跑轮实验、负重游泳实验等常作为小鼠耐力和疲劳状态等指标的评价方法[15]。因此，本实验采用跑轮实验模型和负重力竭游泳模型验证DMY的抗疲劳作用，并对其缓解疲劳的机制深入研究。研究结果表明，DMY 显著延长了小鼠跑步力竭距离和负重游泳力竭时间，对提高小鼠运动耐力及缓解体力疲劳有显著作用。

葡萄糖是肌肉活动时能量的主要来源，主要以糖原的形式储存在肝脏和肌肉中[16]。糖原的含量与机体的运动耐力有密切关系。机体运动时，肌糖原直接消耗提供能量，随着肌糖原逐渐减少，为了维持血糖稳定，肝糖原会分解成葡萄糖，如果肝糖原耗竭，血糖明显下降，运动不能继续，因此肝糖原的储量直接反映机体运动耐力的水平。肝糖原储备越多，运动持续时间越长，运动耐力越强，抗疲劳作用越强[17]。运动后，DMY 各组小鼠的肝糖原水平显著高于对照组，证明了DMY缓解疲劳的有效性。

当剧烈运动时，机体呈现相对无氧状态，肌肉糖酵解供能占主导，肌肉和血液中积累大量LD，同时LDH 控制着肌肉LD 的代谢反应，LD 增多，H+浓度增加，引起机体神经传导、糖酵解及肌肉收缩等功能障碍，影响能量的产生、释放和储存，进一步导致疲劳发生[18-19]。当运动时间延长，糖和脂肪酸的氧化无法满足能量供应时，蛋白质和氨基酸代谢增加维持能量供应，导致血清BUN 含量增加，反映机体对负荷的适应能力较差。此外，血清BUN 的含量越少，也说明机体内蛋白质代谢参与供能较少，糖和脂肪类能源物质供应充足，这可以与肝糖原的实验结果相印证。另外，血清中CK 的含量是反映机体过度劳累及间接反映肌肉损伤的重要指标。CK的活性升高，提示肌肉受损及机体疲劳[20-21]。与文献报道的结果相似，本研究结果证明，DMY 可以显著降低疲劳小鼠肌肉LD，血清LD、SUN 的含量，降低血清LDH 和CK 的活性，具有缓解疲劳的作用，改善了疲劳小鼠的能量代谢水平。

AMPK 途径在机体的能量合成和代谢中有重要作用。在运动过程中，肌肉中的AMPK 受上游AMPK 激酶，包括肝激酶1（LKB1）和钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶1（CaMKK1）和CaMKK2 的调节[22]。AMPK 下游的SIRT1 是一种烟碱腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖性的蛋白去乙酰化酶，参与调节生物代谢过程，可以激活PGC-1α基因表达[20]，从而调节葡萄糖代谢、葡萄糖摄取及线粒体的生物合成[23]。本研究结果表明，DMY 显著增加LBK1、CaMKK2 mRNA 表达，激活AMPKα2 及下游SIRT1和PGC-1αmRNA 的表达，并且显著增加了AMPK磷酸化水平，表明DMY 可能激活了AMPK 能量代谢途径，为肌肉运动提供更多能量。

当剧烈运动时，机体进入氧化应激状态，产生大量活性氧（ROS）自由基，影响机体生物大分子的氧化，从而加速疲劳的产生[24]。此时，机体的抗氧化能力对于缓解机体疲劳有重要作用。肝脏是体内代谢的重要器官，在运动过程中，除储存糖原外，也参与调节GSH-Px 等抗氧化酶的分泌。GSH-Px 是一种机体广泛存在的过氧化物分解酶，可以清除ROS 等代谢产物，调节机体的氧化平衡，保护细胞正常功能[25-26]。本研究表明，DMY 高剂量可以增加抗氧化酶GSH-Px 活性，提示DMY 抗氧化的作用机制可能与GSH-Px 的促分泌有关。进一步探讨DMY抗氧化的可能作用机制，Nrf2 是细胞抗氧化的重要因子，其活化后进入细胞核，与抗氧化反应元件结合，激活下游HO-1、GPx-1等抗氧化基因表达及抗氧化酶GSH-Px 的分泌[3]。实验结果表明，DMY 可以显著上调肝脏Nrf2、HO-1和GPx-1基因的表达及显著增加肝Nrf2 蛋白的表达，提示DMY 可能作用Nrf2相关通路发挥抗氧化作用。

此外，PPAR 是一类激素受体，其中PPARα的表达可以增强机体的氧化能力，改善脂质代谢[27]，并且PPARα可以调控下游UCP2 的分泌，在线粒体的氧化应激中发挥重要作用[28]。已有文献报道DMY可以上调疲劳小鼠肌肉中PGC-1α和PPARα基因表达[10]。在本研究中，实验结果显示，DMY 可以显著上调肝脏PPARα和UCP2基因表达，并且其显著上调了肝PPARα蛋白表达，提示DMY 可能作用PPARα相关通路提高疲劳小鼠抗氧化的能力。

综上所述，DMY 可能通过激活肌肉AMPK 通路及肝Nrf2 和PPARα相关通路改善小鼠疲劳。本研究报道了DMY 对上调Nrf2 和PPARα蛋白表达的显著作用，为DMY 抗疲劳的机制探索提供了参考，相关的机制研究仍需深入，以助力DMY 的深度开发。